激活突變酪氨酸磷酸酶SHP-2參與髓系增殖性疾病的機(jī)制探討.pdf

1、目的：通過研究證實(shí)激活突變的酪氨酸磷酸酶SHP-2（PTPN11）是否參與髓系增殖性疾病的發(fā)生，以及初步探討SHP-2參與髓系增殖性疾病可能的分子機(jī)制。
　　 方法：首先檢測比較野生型(Wild type,WT)、SHP-2 突變型(SHP-2 D61G/+)小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的變化，及其隨周齡的增長變化關(guān)系（即用8 周齡和16 周齡的外周血白細(xì)胞做結(jié)果對比）；比較脾臟大小，運(yùn)用16周齡WT組與SHP-2 D61G/+突變組脾臟

2、做結(jié)果比較，并分別取8w、16w 小鼠的脾臟計(jì)算SI （spleen index=spleen weight （mg）/mouse weight）值以確定脾臟的相對增大程度。應(yīng)用流式細(xì)胞儀（Flow Cytometry,FCM）技術(shù)分別測定WT 組、SHP-2 D61G/+突變組小鼠外周血白細(xì)胞表面標(biāo)志分子（Mac-1、Gr-1）、并統(tǒng)計(jì)Mac-1的陽性細(xì)胞率及骨髓細(xì)胞中Ter119 (紅系)、Mac-1和Gr-1 (髓系)、CD3 (

3、T 淋巴細(xì)胞系)、B220 (B 淋巴細(xì)胞系)的陽性細(xì)胞率。同時(shí)對兩組髓系細(xì)胞運(yùn)用細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)(Cell Colony forming Units，CFU)分析髓系細(xì)胞集落形成能力及通過計(jì)數(shù)觀察細(xì)胞增殖情況的差異。分離培養(yǎng)髓系細(xì)胞獲得肥大細(xì)胞，MTS 法檢測肥大細(xì)胞在IL3(白介素-3 或稱多集落刺激因子multi-F）誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖性差異。SDS-PAGE和Western blot 檢測肥大細(xì)胞中Erk、Art在IL3 誘導(dǎo)下的

4、磷酸化水平與表達(dá)情況。 Western blot和IP 檢測IL3 刺激下肥大細(xì)胞中SHP-2與Gab-2(Grb2 相關(guān)結(jié)合蛋白2)的結(jié)合情況。
　　 結(jié)果：SHP-2 D61G/+突變組小鼠較WT 組外周血白細(xì)胞數(shù)明顯升高（P<0.05）、小鼠的脾臟也明顯增大，8 周齡、16 周齡SHP-2 D61G/+突變組小鼠測得的SI 值也較WT 組明顯升高；流式結(jié)果顯示16 周齡SHP-2 D61G/+突變組的外周血白細(xì)胞的Mac-

5、1、Gr-1增多，Mac-1 陽性細(xì)胞率增加，骨髓髓系細(xì)胞中Mac-1、Gr-1的陽性細(xì)胞率也增多，但紅系、淋巴細(xì)胞系的變化不明顯。對兩組小鼠髓系細(xì)胞用IL3 誘導(dǎo)后，SHP-2 D61G/+組比WT 組的髓系細(xì)胞集落形成能力增強(qiáng)、肥大細(xì)胞中Erk和Akt的磷酸化水平明顯升高；SHP-2 D61G/+雜合突變后與Gab-2 結(jié)合能力增高。提示SHP-2 D61G/+突變導(dǎo)致髓系細(xì)胞發(fā)生增殖、重要信號分子Erk、Art的磷酸化水平提高以及