小分子化合物ADS-J1抑制HIV-1進(jìn)入靶細(xì)胞的作用機(jī)理研究.pdf

1、人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)通過(guò)它的包膜糖蛋白表面gp120 亞基與靶細(xì)胞上CD4和輔助受體分子/黏附分子受體(趨化因子受體CXCR4和CCR5等)先后發(fā)生結(jié)合而進(jìn)入靶細(xì)胞。隨后包膜糖蛋白跨膜亞基gp41構(gòu)象發(fā)生改變,其N-末端的融合肽插入到宿主細(xì)胞膜內(nèi),啟動(dòng)病毒包膜和靶細(xì)胞膜融合,完成病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的感染過(guò)程。因此,HIV-1 gp41在病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的早期環(huán)節(jié)起關(guān)鍵作用,另外,gp41也可以作為開(kāi)發(fā)HIV-1進(jìn)入抑制劑的一個(gè)

2、重要靶點(diǎn)。
　　 本研究我們通過(guò)time-of-addition實(shí)驗(yàn)和HIV-1病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)顯示,ADS-J1是一種HIV進(jìn)入抑制劑。進(jìn)一步的作用機(jī)制研究確定ADS-J1既不能阻止gp41-CD4之間的結(jié)合,又不能與HIV-1的輔助受體CXCR4相互作用。然而,通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(N-PAGE)和圓二色譜(CD)分析確定,ADS-J1抑制了衍生于病毒gp41 N-末端重復(fù)序列(N

3、HR)和C-末端的重復(fù)序列(CHR)多肽所模擬的融合活性核心結(jié)構(gòu)的形成。此外,運(yùn)用等離子表面共振(SPR)實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)ADS-J1能直接與一個(gè)包含gp4l口袋區(qū)的三聚體多肽IQN17結(jié)合,導(dǎo)致后者的構(gòu)象發(fā)生變化而不能結(jié)合另外一個(gè)小的D-肽PIE7。
　　 研究方法:
　　 一、ADS-J1抗HIV-1感染的活性檢測(cè)方法:MT-2 細(xì)胞與HIV-1ⅢB病毒混合,分別共同孵育0、1、2、3、4、6和8小時(shí)。加入ADS-J1

4、后繼續(xù)孵育。對(duì)照組中每孔加入AZT。洗去游離的病毒和ADS-J1,換上新的培養(yǎng)液后再孵育。四天后,收集培養(yǎng)上清,用5％Triton X-100完全裂解病毒顆粒。稀釋的HIVIG抗體4℃包被過(guò)夜。脫脂奶粉封閉,PBS-T充分洗板。加入病毒裂解液,再孵育和洗板。加入抗p24的單克隆抗體183-12H-5C,繼續(xù)孵育和洗板。依次加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG和鏈親合素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化酶(SA-HRP),孵育和洗板。每孔加入3,3’,5,5’-四

5、甲基聯(lián)苯胺(TMB)液顯色。加入終止液終止反應(yīng)。然后在酶標(biāo)儀以450 nm測(cè)量波長(zhǎng)(570 nm參考波長(zhǎng))讀取各孔的光密度值。
　　 最后用CalcuSyn(Biosoft公司產(chǎn)品)軟件來(lái)計(jì)算待測(cè)多肽抑制HIV-1復(fù)制的活性及IC50。
　　 二、HIV-1介導(dǎo)的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。按文獻(xiàn)22,25和33所述的方法,通過(guò)一個(gè)染料轉(zhuǎn)移的試驗(yàn)來(lái)確定HIV-1介導(dǎo)的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。熒光試劑Calcein-AM標(biāo)記的H9/HIV-1ⅢB

6、細(xì)胞分別不同濃度的ADS-J1混合,孵育后按1:5的細(xì)胞比例,加入MT-2細(xì)胞中,繼續(xù)孵育2小時(shí)。熒光倒置顯微鏡,根據(jù)熒光彌散現(xiàn)象,記數(shù)融合及未融合的細(xì)胞。最后按文獻(xiàn)22所述的方法計(jì)算抑制百分比和ECso值。
　　 三.ADS-J1抑制gp41同CD4相互作用的實(shí)驗(yàn)。按文獻(xiàn)56所述的方法,來(lái)檢測(cè)有或沒(méi)有抑制劑ADS-J1存在的情況下gp41同CD4的相互作用。羊抗gp120單克隆抗體D7324稀釋液4℃包被過(guò)夜。脫脂奶粉封閉和充

7、分洗板。依次加入的重組gp120、sCD4、兔抗sCD4抗體后孵育和充分沈板。依次加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG和鏈親合素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化酶(SA-HRP),孵育和洗板。每孔加入3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)液顯色。加入終止液終止反應(yīng)。然后在酶標(biāo)儀以450 nm測(cè)量波長(zhǎng)(570 nm參考波長(zhǎng))讀取各孔的光密度值。
　　 四.ADS-J1抑制CXCR抗體與CXCR表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。按文獻(xiàn)55所述的方法,

8、U373-MAGI-CXCR4CEM細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)直至鋪滿底層。室溫條件下,用5％的甲醛溶液固定細(xì)胞。用PBS-T溶液洗板和脫脂奶粉封閉。加入單克隆抗體12G5(對(duì)照組中加入IgG2a)后孵育充分洗板。依次加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG和鏈親合素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化酶(SA-HRP),孵育和洗板。每孔加入3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)液顯色。加入終止液終止反應(yīng)。然后在酶標(biāo)儀以450 nm測(cè)量波長(zhǎng)(570 nm參考波長(zhǎng))讀取各孔的光密

9、度值。
　　 五、檢測(cè)六螺旋束形成的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)。兔抗gp41多抗4℃包被過(guò)夜。脫脂奶粉封閉后洗板。N36中加入不同濃度的ADS-J1,孵育后加)kC34,繼續(xù)孵育。將上一步孵育好的混合液移入已包被和封閉好的相應(yīng)孔中,孵育和洗板。加入單克隆抗體:NC-1,孵育后洗板。依次加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG和鏈親合素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化酶(SA-HRP),孵育和洗板。每孔加入3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)液顯色。加入終

10、止液終止反應(yīng)。然后在酶標(biāo)儀以450 nm測(cè)量波長(zhǎng)(570 nm參考波長(zhǎng))讀取各孔的光密度值。對(duì)照組將N36與C34孵育后,再加入ADS-J1,按上述方法檢測(cè)A450光密度值。
　　 六、天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(N-PAGE)實(shí)驗(yàn)。N36加入PBS或不同濃度的ADS-J1,孵育后加入C34(使N36和C34的終濃度達(dá)到40gM),混合物繼續(xù)孵育。孵育好的混合液與2×Tris-甘氨酸天然凝膠上樣緩沖液混勻,加樣到10×0.1cm的天

11、然聚丙烯酰胺凝膠孔中(每孔25 μl),室溫下靜置5分鐘。室溫125V電壓電泳2小時(shí),考馬斯亮藍(lán)R250染色2小時(shí),脫色后用FluorChem 8800凝膠成像儀拍照記錄。
　　 七、免疫印跡檢測(cè)六螺旋束。N36/C34經(jīng)過(guò)N-PAGE電泳之后轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上。膜切成帶狀,用封閉溶液(含有5％脫脂奶粉的TBS)4℃條件下封閉過(guò)夜。用PBS稀釋的單克隆抗體NC-1(10μg/ml)與膜孵育2小時(shí)。依次加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG鏈

12、霉親合素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化酶(SA-HRP),37℃條件下各孵育1小時(shí)。加入化學(xué)發(fā)光試劑。壓片并記錄圖像。
　　 八、圓二色譜分析。N36、C34和ADS-J1溶解于PBS(pH7.2)中。N36分別與ADS-J1和PBS孵育后加入C34。多肽(N36、C34)和ADS-J1的終濃度分別為10 μM和40 μM。繼續(xù)孵育后冷卻到室溫。N36、C34、N36與C34的復(fù)合物和ADS-J1的反應(yīng)物用Jasco分光偏振儀測(cè)定圓二色譜。參

13、數(shù)設(shè)置:檢測(cè)溫度:4℃,樣品池:0.1cm,波長(zhǎng)掃描范圍:180～300nm,波寬:5.0 nm,狹縫0.1 nm,時(shí)間常數(shù)4.0 s,掃描速度:50 nm/min。以N36和C34在37℃孵育后的復(fù)合物作為陽(yáng)性對(duì)照,空白溶液做為陰性對(duì)照。在222 am以5℃/min的溫度剃度變化監(jiān)測(cè)多肽的熱變性。減去緩沖液的空白對(duì)照來(lái)校正譜值。對(duì)溶解曲線進(jìn)行平滑化處理,并用Jasco應(yīng)用軟件計(jì)算熱解離轉(zhuǎn)變的中點(diǎn)溫度,即Tm值。
　　 九、表面

14、等離子共振測(cè)定。通過(guò)氨基共價(jià)偶聯(lián)將生物素標(biāo)記的IQN-17(2μg/ml)固定到鏈霉親和素傳感器(CM5)的表面,用1M濃度的Tris-HC1(pH8.5)來(lái)封閉未發(fā)生反應(yīng)的傳感器的表面。芯片用磷酸緩沖液(pH 7.4,20μg/ml)進(jìn)行洗滌和平衡。加入用流動(dòng)相(PBS)稀釋的不同濃度的ADS-J1,注射體積為200μl,流速為5μl/min,25℃條件下測(cè)量,結(jié)合時(shí)間為10min,接著進(jìn)行15min的解離。每個(gè)循環(huán)結(jié)束后,用0.1

15、M鹽酸甘氨酸(pH 2.5)作用30秒來(lái)復(fù)性傳感器芯片。用商業(yè)化的BIAeval Version3.0軟件對(duì)共振數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)算動(dòng)力學(xué)解離常數(shù)。ADS-J1與生物素標(biāo)記IQN-17的親和力通過(guò)他們之間劑量依賴的結(jié)合來(lái)確定。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。AMD-3100、生物素標(biāo)記的PIE7和亂序的生物素標(biāo)記的PIE7用作ADS-J1的空白對(duì)照,多肽IQ用作IQN-17的空白對(duì)照。
　　 十、酸性天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(AN-PAGE)。多

16、肽N36、N36-F17、N36-F10、和N36K574D(終濃度為80 μM)分別加入或不加ADS-J1(終濃度為50 μM),37℃條件下孵育30分鐘。孵育好的混合液與等量的2×酸性膠上樣緩沖液混勻,加樣到10％的酸性聚丙烯酰胺凝膠孔中(每孔25-30μl),室溫條下靜置5分鐘。室溫下120V電壓電泳100至120分鐘(反接電極),凝膠在固定液(0.5％戊二醛,30％乙醇)中固定20分鐘。
　　 結(jié)論:
　　 一、

17、Time-of-addition實(shí)驗(yàn)和HIV-1病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)顯示,ADS-J1是一種HIV進(jìn)入抑制劑。
　　 二、ADS-J1既不能阻止gp120-CD4之間的結(jié)合,又不能與HIV-1的輔助受體CXCR4相互作用。
　　 三、通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(N-PAGE)和圓二色譜(CD)分析確定,ADS-J1抑制了衍生于病毒gp41N-末端重復(fù)序列(NHR)和C-末端的重復(fù)序列(C

18、HR)多肽所模擬的融合活性核心結(jié)構(gòu)的形成。四、等離子表面共振(SPR)實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn).ADS-J1能直接與一個(gè)包含gp41口袋區(qū)的三聚體多肽IQN17結(jié)合,導(dǎo)致后者的構(gòu)象發(fā)生變化而不能結(jié)合另外一個(gè)小的D-肽PIE7。
　　 五、采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳第一次用直觀的證據(jù)發(fā)現(xiàn),ADS-J1能直接同N-多肽結(jié)合且結(jié)合靶點(diǎn)位于復(fù)合螺旋核中的口袋區(qū)(氨基酸565-581)。位于gp41口袋區(qū)第574位帶正電荷的賴氨酸(K574)在AD