人精漿游離核酸作為睪丸-附睪表觀遺傳無(wú)創(chuàng)性標(biāo)記物的研究.pdf

1、第一部分：人精漿中主要來(lái)自睪丸和附睪的miRNAs鑒定
　　背景與目的:學(xué)者們一直期待能開發(fā)男性不育表觀遺傳標(biāo)記物,目前主要通過(guò)睪丸和附睪組織獲取與精子發(fā)生和成熟相關(guān)的表觀遺傳信息,對(duì)睪丸和附睪組織依賴限制了其在人的研宄。近來(lái),在人精楽中發(fā)現(xiàn)大量miRNA(cell-free seminal miRNA,cfs-miRNA),近期研宄提示可作為男性不育無(wú)創(chuàng)診斷的潛在標(biāo)記物。睪丸和附睪是精子發(fā)生和成熟的主要器官,主要來(lái)自于睪丸和附睪

2、的精液miRNAs能可靠反映這些器官的表達(dá)譜,有望為男性不育提供可靠的表觀遺傳無(wú)創(chuàng)性標(biāo)記物。為此,我們鑒定了人cfs-miRNA中主要來(lái)自于睪丸和附睪的miRNAs。
　　方法:由于成功輸精管切除的射出精液中不含有任何睪丸和附睪分泌物,通過(guò)Solexa測(cè)序比較5例輸精管切除混合cfs-miRNA和4例精液參數(shù)正?；旌蟘fs-miRNA中miRNAs譜含量,篩選出主要來(lái)自睪丸和附睪的miRNAs。分別提取3例輸精管切除和4例精液參數(shù)

3、正常cfs-miRNA,通過(guò)RT-qPCR方法對(duì)篩選出的miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:在精液參數(shù)正常精漿中,共發(fā)現(xiàn)84個(gè)miRNAs濃度為輸精管切除精漿4倍以上。RT-qPCR結(jié)果證實(shí)有61個(gè)miRNAs主要來(lái)自睪丸和附睪。其中,有屬于5個(gè)miRNA家族的28個(gè)miRNAs分布于X染色體上。
　　結(jié)論:本研宄篩選和鑒定了主要來(lái)自睪丸和附睪的精漿miRNAs,這些miRNAs有望作為無(wú)創(chuàng)性標(biāo)記物用于精子發(fā)生和成熟異常的病因

4、和病理生理研究。
　　第二部分：人精漿中附睪miRNAs作為特發(fā)性弱精子癥無(wú)創(chuàng)標(biāo)記物的初探
　　背景與目的:游離miRNA在妊娠、腫瘤、心血管疾病、組織損傷等生理病理過(guò)程中表達(dá)失調(diào),有望成為研宄和診斷多種疾病的新分子標(biāo)志物。我們前期在人精漿游離miRNA中鑒定了一些主要來(lái)源于睪丸和附睪的miRNAs。miRNA分子在精子發(fā)生和精子成熟中起重要調(diào)控作用。由此推測(cè),附睪來(lái)源的miRNAs可能與精子成熟密切相關(guān),在一些特發(fā)性弱精子

5、癥患者中存在miRNA失調(diào)狀態(tài),這種失調(diào)可通過(guò)定量分析cfs-miRNA得到反映,而精漿中失調(diào)的附睪miRNAs可作為特發(fā)性弱精子癥的無(wú)創(chuàng)性標(biāo)記物。本實(shí)驗(yàn)以特發(fā)性弱精子癥為對(duì)象,對(duì)這一推測(cè)進(jìn)行證實(shí)。
　　方法:收集20例精液參數(shù)正常和22例弱精子癥的精液,弱精子癥患者無(wú)生殖道解剖結(jié)構(gòu)異常,無(wú)精索靜脈曲張,無(wú)隱睪癥、腮腺炎、食用生棉籽油、睪丸扭轉(zhuǎn)、高燒、生殖道感染、毒癮、暴露化學(xué)物質(zhì)或高溫環(huán)境病史。精液培養(yǎng)結(jié)果為陰性,促性腺激素、催

6、乳素、睪酮、雌二醇、卵泡雌激素和促黃體生成素的血清學(xué)檢查結(jié)果正常。排除精漿PH值和精液液化異常,且未出現(xiàn)已知的可能性遺傳學(xué)病因、免疫疾病和其它系統(tǒng)性疾病。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè)附睪來(lái)源的13個(gè)cfs-miRNAs(miR-888、miR-890、miR-891a、miR-891b、miR-892a、miR-892b、miR-660、miR-421、miR-221、miR-200b、miR-220c、miR-187和miR-181c

7、)在精液參數(shù)正常精漿和弱精子癥精漿中含量的差異性,以普遍表達(dá)的miR-30d,miR-93和miR-107作為內(nèi)參,取3個(gè)內(nèi)參的平均CT值作為內(nèi)參CT值來(lái)計(jì)算cfs-miRNAs的相對(duì)含量。
　　結(jié)果:5個(gè)來(lái)源于附睪的游離miRNAs(miR-888、miR-890、miR-891a、miR-891b和miR-892a)相對(duì)含量在特發(fā)性弱精子癥的精漿中表現(xiàn)為明顯下降,差異有顯著性意義(尺0.05)。這些附睪特異性表達(dá)miRNAs均

8、屬于X-染色體miR-890/891a家族,在附睪形態(tài)發(fā)生和精子成熟中有重要作用。另外,8個(gè)來(lái)源于附睪的游離miRNAs(miR-892b、miR-660、miR-421、miR-221、miR-200b、miR-220c、miR-187和miR-181c)相對(duì)含量在兩種精漿標(biāo)本中沒(méi)有明顯的差異,差異無(wú)顯著性意義(辦0.05)。
　　結(jié)論:附睪來(lái)源的miRNA與精子成熟密切相關(guān),cfs-miRNAs(miR-888、miR-890

9、、miR-891a、miR-891b和miR-892a)的下調(diào)可能是導(dǎo)致精子活力下降的表觀遺傳學(xué)病因,也可能是其它不利于精子活力病因的中間作用環(huán)節(jié)。cfs-miRNA可望成為無(wú)創(chuàng)性研宄部分特發(fā)性不育表觀遺傳病因和機(jī)制的新分子標(biāo)志物。
　　第三部分：人精漿游離DNA中睪丸和附睪啟動(dòng)子甲基化譜的鑒定
　　背景與目的:DNA甲基化在精子發(fā)生與成熟的甲基化重建中起重要作用,已證實(shí)在不育男性睪丸或精子中存在一些基因啟動(dòng)子的異常甲基化。

10、我們之前在人精漿發(fā)現(xiàn)高濃度的游離DNA。我們假設(shè)在人精楽游離DNA(cell-free seminal DNA,cfsDNA)能檢測(cè)到一些睪丸和附睪特異性甲基化啟動(dòng)子,從而有望為精子發(fā)生和精子成熟異常引起的男性不育提供無(wú)創(chuàng)性表觀遺傳標(biāo)記物。為此,我們鑒定人精漿中睪丸和附睪特異性甲基化啟動(dòng)子。
　　方法:我們通過(guò)NimbleGen HG18 Refseq啟動(dòng)子芯片分別檢測(cè)6例精液參數(shù)正常混合cfsDNA和6例輸精管切除混合cfsDN

11、A中的啟動(dòng)子甲基化情況,篩選睪丸和附睪特異性甲基化啟動(dòng)子。分別通過(guò)MeDIP-qPCR和MethyLight在精液參數(shù)正常和輸精管切除的cfsDNA中檢測(cè)甲基化芯片篩選的10個(gè)和9個(gè)不同睪丸和附睪特異性甲基化啟動(dòng)子。通過(guò)Gene Ontology分析對(duì)睪丸和附睪特異性甲基化基因進(jìn)行功能歸類。
　　結(jié)果:我們鑒定了367個(gè)睪丸和附睪特異性低甲基化基因和134個(gè)睪丸和附睪特異性高甲基化基因的啟動(dòng)子。MeDIP-qPCR證實(shí)啟動(dòng)子芯片結(jié)

12、果中的8個(gè)睪丸和附睪特異性低甲基化啟動(dòng)子(DAZ1、DNMT3L、GML、HOXA5、MSH4、MORCI、PRAME和SNURF\MethyLight分析證實(shí)了啟動(dòng)子芯片結(jié)果中的2個(gè)睪丸和附睪特異性高甲基化啟動(dòng)子(CHRFAM7A和USP28、和6個(gè)睪丸和附睪特異性高甲基化啟動(dòng)子(ERRFl、FBRS、GLTPD1、HSFl、VPS16$WZNF623\GeneOntology分析顯示一些睪丸和附睪特異性甲基化基因與男性生殖、附睪重吸

13、收、分泌和防御功能有關(guān)。
　　結(jié)論:我們?cè)赾fsDNA中檢測(cè)到睪丸和附睪特異性甲基化啟動(dòng)子,這些啟動(dòng)子可能作為無(wú)創(chuàng)性表觀遺傳標(biāo)記物用于男性不育的研宄和診斷。
　　第四部分：NOA患者cfsDNA中睪丸特異性甲基化啟動(dòng)子定量
　　背景與目的:DNA甲基化在精子發(fā)生中起重要作用,睪丸組織獲取困難限制了其在人的研宄。我們前期在cfsDNA中鑒定了睪丸/附睪特異性甲基化啟動(dòng)子。精子發(fā)生過(guò)程中,從生殖祖細(xì)胞開始到最后精子形成逐步

14、重建基因啟動(dòng)子甲基化,我們推測(cè)睪丸特異性甲基化啟動(dòng)子在不同病理類型NOA患者睪丸中的甲基化狀態(tài)會(huì)有一定差異,其差異能通過(guò)分析對(duì)應(yīng)cfsDNA的啟動(dòng)子甲基化水平得到反映。而且,可能發(fā)現(xiàn)生精功能低下與其它無(wú)精子形成的NOA之間的差異性甲基化啟動(dòng)子,這些差異性甲基化啟動(dòng)子具有預(yù)測(cè)睪丸精子提取的潛力。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)檢測(cè)不同病理類型NOA患者睪丸及精漿中睪丸特異性甲基化啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)對(duì)這一推測(cè)進(jìn)行證實(shí)。
　　方法:收集14例NOA睪丸組

15、織(5例生精阻滯和9例生精功能低下)和相應(yīng)精液(5例生精阻滯和4例生精功能低下),用于研宄所選取的啟動(dòng)子甲基化在睪丸組織結(jié)果與cfsDNA結(jié)果,及睪丸組織基因表達(dá)的相關(guān)性;收集68例NOA患者精液(17例唯支持細(xì)胞綜合征、25例生精阻滯、26例生精功能低下)和24例精液參數(shù)正常精液,用于研宄所選取啟動(dòng)子甲基化水平差異。通過(guò)MethyLight檢測(cè)14例睪丸和101例cfsDNA中6個(gè)睪丸特異性甲基化啟動(dòng)子iACRBP、CCNAI、CIB

16、I、DMRTl、^7577和MORCf)相對(duì)甲基化水平。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄定量PCR檢測(cè)14例睪丸中6個(gè)基因相應(yīng)mRNA表達(dá)水平。分析9例睪丸組織啟動(dòng)子甲基化水平和對(duì)應(yīng)精漿啟動(dòng)子甲基化水平相關(guān)性,分析14例睪丸組織基因啟動(dòng)子甲基化水平與相應(yīng)的mRNA水平的相關(guān)性,分析68例不同病理類型NOA及24例精液參數(shù)正常男性精液?jiǎn)?dòng)子甲基化水平變化,比較26例生精功能低下和42例非生精功能低下的NOA患者cfsDNA的啟動(dòng)子甲基化水平差異并進(jìn)行ROC曲線

17、分析。
　　結(jié)果:睪丸中CIBI、CCNAI、DMRTl、＃577/和啟動(dòng)子甲基化水平與對(duì)應(yīng)cfsDNA中啟動(dòng)子甲基化水平相關(guān)系數(shù)分別為0.90、0.94、0.79、0.99、0.90和0.92,與睪丸相應(yīng)mRNA表達(dá)水平相關(guān)系數(shù)分別為-0.667、-0.586、-0.609、-0.584、-0.806和-0.774。不同病理類型NOA及精液參數(shù)正常精液的CIBI、CCNAI、DMRTI、HSFl和MORCl啟動(dòng)子甲基化水平呈動(dòng)態(tài)

18、變化趨勢(shì)。其中,CCNAl和DMRTl啟動(dòng)子甲基化水平在生精功能低下NOA與非生精功能低下NOA差異明顯,P值分別為0.032和0.065。DMRTl甲基化啟動(dòng)子預(yù)測(cè)生精功能低下NOA患者的敏感性分別為27.27％和36.36%,特異性均為94.44%。
　　結(jié)論:NOA患者cfsDNA的睪丸特異性啟動(dòng)子甲基化水平能反映對(duì)應(yīng)睪丸的啟動(dòng)子甲基化水平,這些啟動(dòng)子可望成為無(wú)創(chuàng)性標(biāo)記物用于NOA病因和發(fā)病機(jī)制研宄,或生精功能低下NOA預(yù)測(cè)