L02人肝細胞在人鼠嵌合肝中增殖的實驗研究.pdf

1、近幾年，嚙齒類動物模型在了解特異基因的功能、代謝通路和疾病進程方面起了巨大的作用。肝炎病毒感染具有明顯的種屬特異性，其易感宿主局限于人及黑猩猩等高級靈長類動物，但黑猩猩、獼猴、樹鼩以及一些轉(zhuǎn)基因動物模型等因為各種原因而限制了其應(yīng)用。 人鼠嵌合肝是利用人肝細胞異種移植到受體鼠肝內(nèi)建立的新型動物模型，該模型解決了肝炎病毒感染的種屬特異性問題，可應(yīng)用于已知和未知肝炎病毒感染的研究。本課題采用誘導(dǎo)免疫耐受的方法建立的動物模型，系構(gòu)建在正

2、常免疫系統(tǒng)基礎(chǔ)上，能夠模擬病毒感染的全過程，可應(yīng)用于研究發(fā)病機制、抗病毒治療和開發(fā)疫苗。 但是，直接移植入鼠肝的人肝細胞，其生存時間有限，要建立穩(wěn)定持久的人鼠嵌合肝動物模型，必須提高移植細胞的增殖能力。若首先給予肝毒性藥物或放射線照射，抑制受體細胞增殖，使移植肝細胞有更強的生長優(yōu)勢，隨后給予外源性生長刺激如部分肝切除，則能顯著提高移植細胞的增殖能力，此即是本課題的出發(fā)點。 本課題采用宮內(nèi)誘導(dǎo)免疫耐受的SD(Sprague

3、-Dawley)大鼠，出生后2～3周注射2-乙酰氨基芴(2-acetaminofluorene，2-AAF)或倒千里光堿(Retrorsine，Rts)抑制受體肝細胞的增殖，后行2/3部分肝切除術(shù)(Partialhepatectomy,PH)刺激再生，同時經(jīng)脾移植DiI(1，1'-Dioctadecyl-3，3，3'，3'-tetramethylindocarbocyanineperchlorate)染色后的L02人肝細胞，從而建立具有

4、正常免疫活性的人鼠嵌合肝動物模型。通過多種方法，檢測人鼠嵌合肝內(nèi)L02人肝細胞的增殖和存活時間，同時進一步完善對人鼠嵌合肝動物模型的檢測手段。 研究目的 探討藥物2-乙酰氨基芴和倒千里光堿，是否可以提高人肝細胞在具有正常免疫活性的人鼠嵌合肝中的增殖及成活時間，從而建立穩(wěn)定持久的人鼠嵌合肝動物模型。 研究內(nèi)容和方法 2-AAF組和Rts組各分配6只SD孕鼠，每組共產(chǎn)胎鼠各約60只，均分為實驗組和對照組大鼠。

5、 一、2-乙酰氨基芴組(2-AFF/PH) 1、大鼠出生前宮內(nèi)腹腔注射L02人肝細胞，誘導(dǎo)胎鼠對L02人肝細胞免疫耐受，出生后2周分別腹腔注射2-AAF(小、中、大劑量)或生理鹽水，于注射結(jié)束后第二日行2/3肝切除術(shù)，同時經(jīng)脾移植DiI染色后的L02人肝細胞，建立人鼠嵌合肝動物模型； 2、觀察2-AAF是否能提高人肝細胞在人鼠嵌合肝中的增殖能力、數(shù)量及成活時間：采用免疫熒光、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetr

6、anscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)、免疫組化、DiI熒光示蹤等方法，在不同時相分別檢測人白蛋白、人白蛋白mRNA、增殖細胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)以及在熒光顯微鏡下觀察L02肝細胞在鼠肝內(nèi)的分布，并采用計算機圖象分析系統(tǒng)分析PCNA陽性細胞的面數(shù)密度和面積密度。 二、倒千里光堿組(Rts/PH) 1、大鼠出生前宮

7、內(nèi)腹腔注射L02人肝細胞，誘導(dǎo)胎鼠對L02人肝細胞免疫耐受，出生后3周、5周分別腹腔注射Rts或生理鹽水，7周后行2/3肝切除術(shù)，同時經(jīng)脾移植DiI染色后的L02人肝細胞，建立人鼠嵌合肝動物模型； 2、觀察Rts是否能提高人肝細胞在人鼠嵌合肝中的增殖能力、數(shù)量及成活時間：采用免疫熒光、RT-PCR、免疫組化、DiI熒光示蹤等方法，在不同時相分別檢測人白蛋白、人白蛋白mRNA、增殖細胞核抗原PCNA以及在熒光顯微鏡下觀察人L02人

8、肝細胞在鼠肝內(nèi)的分布，并采用計算機圖象分析系統(tǒng)分析PCNA陽性細胞的面數(shù)密度和面積密度。 研究結(jié)果 一、2-乙酰氨基芴組(2-AAF/PH) 1、2-AAF實驗組(小、中、大劑量)與對照組比較均無明顯區(qū)別； 2、移植后1～10周在熒光顯微鏡下觀察到L02人肝細胞在鼠肝內(nèi)的動態(tài)分布； 3、移植后2～8周大鼠肝組織中檢測出人白蛋白及人白蛋白mRNA； 4、移植后2～6周大鼠肝組織中檢測出特異性

9、人PCNA；移植后1～8周檢測出非特異性PCNA。 二、倒千里光堿組(Rts/PH) 1、實驗組移植后1周～6月在熒光顯微鏡下觀察到L02人肝細胞在鼠肝內(nèi)的動態(tài)分布； 2、實驗組移植后2周～6月大鼠肝組織中檢測出人白蛋白及人白蛋白mRNA； 3、實驗組移植后2周～6月大鼠肝組織中檢測出特異性人PCNA；實驗組與對照組均于移植后1周～6月檢測出非特異性人PCNA； 4、除非特異性人PCNA檢測外，其

10、余對照組檢測結(jié)果與2-乙酰氨基芴組相同。 結(jié)論 1、2-AAF/PH模型中，2-乙酰氨基芴對移植的L02人肝細胞無明顯增殖作用；L02人肝細胞在2-乙酰氨基芴處理人鼠嵌合肝動物模型中存活10周，產(chǎn)生白蛋白功能持續(xù)8周； 2、Rts/PH模型中，倒千里光堿對移植的L02人肝細胞有明顯的增殖作用，L02人肝細胞在人鼠嵌合肝動物模型中存活、增殖并產(chǎn)生白蛋白達6月以上； 3、人鼠嵌合肝中的L02人肝細胞在形態(tài)和功