反相離子對色譜法及高效毛細(xì)管電泳法測定脫氧精胍菌素及其有關(guān)物質(zhì).pdf

1、免疫抑制劑是一類具有免疫抑制作用的藥物，可抑制機(jī)體異常的免疫反應(yīng)，目前已廣泛用于器官移植抗排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療。免疫抑制劑的不斷更新及在臨床的實際應(yīng)用，使當(dāng)今的器官移植取得了巨大的成功。 脫氧精胍菌素(DSG)是一種全新的免疫抑制劑，不僅能有效地阻止移植器官排異，而且能逆轉(zhuǎn)急性排異反應(yīng)，由于DSG的免疫抑制作用強(qiáng)，毒性較低，特別是對肝、腎以及神經(jīng)幾乎沒有毒副作用，因此，該新藥為臨床免疫抑制劑的應(yīng)用提供了又一新的選擇。

2、 為了研究開發(fā)脫氧精胍菌素，將該新藥盡快推向臨床，必須建立準(zhǔn)確、可靠的分析方法，為合成工藝研究、制劑研究、質(zhì)量研究和穩(wěn)定性研究打下基礎(chǔ)，本文建立了脫氧精胍菌素的反相離子對色譜分離分析方法，有效的解決了脫氧精胍菌素在反相色譜柱上不保留的問題，為脫氧精胍菌素的含量及有關(guān)物質(zhì)測定提供了一個簡便有效的分析手段。同時，本文還建立了脫氧精胍菌素的高效毛細(xì)管電泳分離分析方法，該法簡便快速，靈敏度高，特異性好，可作為該藥物高效液相分析方法的補(bǔ)充和

3、完善，為該藥物提供了一種新的分離分析手段。 目的：建立脫氧精胍菌素及其有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜分析方法和高效毛細(xì)管電泳分析方法，并對新方法進(jìn)行方法學(xué)研究，分析測定實際樣品中的有關(guān)物質(zhì)和含量，為脫氧精胍菌素的研究開發(fā)提供可靠的分析方法。 方法： 1.反相離子對色譜法 (1)通過對不同色譜柱，不同流動相的組成、配比、流速及柱溫的優(yōu)化選擇，確定最佳的色譜分離條件，并對所建立的新方法進(jìn)行方法學(xué)驗證。 (2)

4、系統(tǒng)適用性試驗：在已確定的反相液相色譜條件下，考察脫氧精胍菌素主峰的理論板數(shù)，并計算拖尾因子。 (3)專屬性試驗：在合適的條件下，對脫氧精胍菌素樣品進(jìn)行熱、堿、酸、氧化、光的破壞，考察加速破壞所產(chǎn)生的雜質(zhì)與主峰的分離。 (4)線性與范圍：配制一系列濃度的脫氧精胍菌素對照品溶液，測定峰面積；以濃度為橫坐標(biāo)，以脫氧精胍菌素主峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (5)精密度試驗：取一份對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，

5、計算峰面積的RSD值。 (6)穩(wěn)定性試驗：取脫氧精胍菌素供試品溶液適量，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8小時，取樣注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算峰面積的RSD值。 (7)回收率：取同一批脫氧精胍菌素供試品適量，按供試品溶液濃度的80％、100％、120％分別配制低、中、高3種濃度的溶液各3份，作為供試品溶液。分別取上述溶液各20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積，計算回收率。 (8)最低檢測限：將脫氧精

6、胍菌素對照品溶液逐步稀釋，使峰高為噪音峰高的3倍，此時對應(yīng)的脫氧精胍菌素的量即為最低檢測限。 (9)樣品測定：對三批脫氧精胍菌素樣品按照已確定的色譜條件進(jìn)行測定。 2.高效毛細(xì)管電泳法 (1)通過對不同緩沖液濃度、pH值、溫度及電壓的選擇，確定最佳的高效毛細(xì)管電泳分離分析條件。 (2)系統(tǒng)適用性試驗：在已確定的高效毛細(xì)管電泳色譜條件下，以脫氧精胍菌素主峰面積考察系統(tǒng)理論板數(shù)，并計算拖尾因子。 (3

7、)專屬性試驗：在合適的條件下，對脫氧精胍菌素樣品進(jìn)行熱、堿、酸、氧化、光的破壞，考察加速破壞所產(chǎn)生的雜質(zhì)與主峰的分離情況。 (4)線性與范圍：配制一系列濃度的脫氧精胍菌素對照品溶液，測定峰面積；以濃度為橫坐標(biāo)，以脫氧精胍菌素主峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (5)精密度試驗：取一份對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算峰面積的RSD值。 (6)穩(wěn)定性試驗：取脫氧精胍菌素供試品溶液適量，室溫下放置，分別于0、2

8、、4、6、8小時，取樣注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算峰面積的RSD值。 (7)檢測限的確定：將脫氧精胍菌素對照品溶液逐步稀釋，測量最高噪音峰的峰高，使樣品峰高為噪音峰高的3倍，此時對應(yīng)的脫氧精胍菌素的量即為最低檢測限。 (8)樣品測定：對三批脫氧精胍菌素樣品按照已確定的色譜條件進(jìn)行測定。 結(jié)果： 1.反相離子對色譜法 (1)色譜條件：色譜柱：Gemini C18色譜柱(250×4.60mm，5μ

9、m Phenomenex公司)；流動相：5mmol/L磷酸氫二鉀水溶液(內(nèi)含5mmol/L戊烷磺酸鈉，用磷酸訓(xùn)pH3.6±0.3)-乙腈(90:10)；檢測波長：210nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μl；流速：1.0ml/min。 (2)系統(tǒng)適用性試驗：以脫氧精胍菌素峰計算的理論板數(shù)為8000，拖尾因子為1.05。 (3)專屬性試驗：脫氧精胍菌素樣品進(jìn)行熱、堿、酸、氧化、光破壞，降解產(chǎn)物可與主成分峰達(dá)基線分離，表明該方

10、法專屬性良好。 (4)線性與范圍：脫氧精胍菌素濃度在0.05-2mg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=5.7×106X+27336，相關(guān)系數(shù)r2為1.000(n=5)。 (5)精密度：按上述條件平行測定6次，脫氧精胍菌素峰面積的RSD為0.26％，表明方法精密度良好。 (6)溶液穩(wěn)定性：供試品溶液室溫下放置0、2、4、6、8小時，脫氧精胍菌素峰面積的RSD為0.40％，表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定

11、。 (7)同收率：低、中、高三個濃度的平均回收率分別為98.5％、99.8％和98.2％，RSD％值分別為0.32％、0.35％和0.29％。試驗結(jié)果表明，該方法回收率高。 (8)最低檢測限：當(dāng)S/N=3時，測得本方法的最低檢測濃度為0.5μg/mL，計算最低檢測量為10ng。(9)樣品測定：三批供試品含量分別為98.8％、98.5％和98.9％；有關(guān)物質(zhì)分別為1.3％、1.4％和1.3％。 2.高效毛細(xì)管電泳法

12、 (1)色譜條件：未涂層石英毛細(xì)管67cm×50μm(有效長度60cm)；緩沖液為75mmol/L磷酸氫二鈉緩沖液(用5％磷酸調(diào)節(jié)pH 2.5)；檢測波長為214nm；電壓為25kV；溫度為30℃；壓力進(jìn)樣5s。 (2)系統(tǒng)適用性：理論板數(shù)按脫氧精胍菌素峰計算為200000，拖尾因子為1.01。 (3)線性與范圍：濃度在0.1-2.0mg/mL范圍內(nèi)脫氧精胍菌素峰面積與濃度值之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=

13、0.8116X+0.07141，相關(guān)系數(shù)r為0.9996(n=5)。 (4)精密度：按上述條件平行測定6次，脫氧精胍菌素峰面積的RSD為0.47％，表明方法精密度良好。 (5)溶液穩(wěn)定性：供試品溶液室溫下放置0、2、4、6、8小時，脫氧精胍菌素峰面積的RSD為0.45％，表明樣品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。 (6)最低檢測限：當(dāng)S/N=3時，測得本方法的最低檢測濃度為3μg/mL，計算最低檢測限為0.19％。 (7