何首烏飲對衰老大鼠生精細胞凋亡機制的初步探討.pdf

1、目的：
　　探討何首烏飲對衰老大鼠生精細胞凋亡的可能機制。
　　方法：
　　1.根據(jù)實驗要求將雄性大鼠分為四組，每組各10只：青年對照組（12月齡）；自然衰老組（18月齡）；何首烏飲1組（何首烏飲4.8g/100g，灌胃60d，18月齡）；何首烏飲2組（何首烏飲4.8g/100g，灌胃30d，18月齡）觀察不同給藥時間藥物延緩衰老作用。
　　2.應用β-半乳糖苷酶試劑盒檢測β-半乳糖苷酶在各組睪丸組織中的表達。<

2、br>　　3.采用TUNEL熒光試劑盒觀察睪丸組織細胞凋亡率。
　　4.采用基因芯片技術(shù)篩選睪丸組織受何首烏飲調(diào)控的差異表達基因，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證芯片結(jié)果。
　　5.選出與細胞凋亡相關(guān)的差異表達基因，從中選取關(guān)鍵基因Caspase-3、DR6、BAX、14-3-3σ，采用qRT-PCR檢測在mRNA水平的改變；同時進行免疫熒光和Western blot觀察以上蛋白和Cytc在睪丸組織中的表達。

3、　　結(jié)果：
　　1.β-半乳糖苷酶表達β-半乳糖苷酶陽性產(chǎn)物呈藍色定位在細胞質(zhì)。青年對照組藍色細胞較少，且主要分布在間質(zhì)細胞；自然衰老組衰老細胞明顯增多且藍染細胞主要是精原細胞和間質(zhì)細胞，β-半乳糖苷酶的陽性率明顯高于青年對照組（P<0.01）；何首烏飲用藥組發(fā)生衰老的細胞主要是間質(zhì)細胞，β-半乳糖苷酶的表達比自然衰老組明顯減少（P<0.01）；用藥組之間比較何首烏飲1組β-半乳糖苷酶的表達明顯低于何首烏飲2組（P<0.01）。<

4、br>　　2.TUNEL檢測睪丸組織凋亡結(jié)果細胞核呈綠色熒光為凋亡細胞。青年對照組細胞凋亡較少，主要分布在間質(zhì)細胞；自然衰老組凋亡陽性信號分布于各級生精細胞，偶見間質(zhì)細胞，細胞凋亡率顯著高于青年對照組(P<0.01)；何首烏飲用藥組凋亡細胞主要是精原細胞和間質(zhì)細胞，與自然衰老組比較凋亡細胞明顯減少(P<0.01)；且何首烏飲1組細胞凋亡率明顯低于何首烏飲2組(P<0.01)。
　　3.基因芯片篩選結(jié)果基因芯片共篩選出21260個基

5、因，受何首烏飲直接調(diào)控的基因有912個，其中衰老后691個基因表達明顯上調(diào)，221個基因表達下調(diào)，用何首烏飲干預60d后，上調(diào)的691個基因明顯下調(diào)，下調(diào)的221個基因明顯上調(diào)。通過Pathway分析受何首烏飲調(diào)控的與細胞周期調(diào)控和凋亡相關(guān)的通路共有13條。
　　4.qRT-PCR驗證芯片結(jié)果我們選擇了9個基因進行驗證，其中AK1,Glrx3,Cabin1，Kdm2b衰老后表達下調(diào)，何首烏飲用藥后表達上調(diào)；Ccng1,GHR,Ca

6、pn8,ADAM5,Cybrd1衰老后表達上調(diào)，何首烏飲用藥后表達下調(diào)。qRT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致，說明芯片結(jié)果可信。
　　5.qRT-PCR檢測Caspase-3、DR6、BAX、14-3-3σ在mRNA水平的改變與青年對照組相比，自然衰老組Caspase-3、DR6、BAX的表達明顯上調(diào)(P<0.01)，14-3-3σ的表達明顯下調(diào)(P<0.01)；何首烏飲1組Caspase-3、DR6、BAX的表達比自然衰老組有所下調(diào)

7、(P<0.01)，14-3-3σ的表達明顯上調(diào)(P<0.01)；何首烏飲2組Caspase-3、DR6的表達比自然衰老組有所下調(diào)(P<0.01)，14-3-3σ的表達無顯著性差異(P>0.05)；且Caspase-3、DR6在兩個用藥組之間無顯著性差異(P>0.05)。
　　6.免疫熒光和Western blot檢測結(jié)果 Caspase-3、Cytc、14-3-3σ陽性產(chǎn)物呈紅色顆粒，Caspase-3定位于各級生精細胞的胞核或胞

8、質(zhì)，Cytc、14-3-3σ表達在各級生精細胞和間質(zhì)細胞的胞質(zhì)中。BAX陽性產(chǎn)物呈紅色顆粒，DR6陽性產(chǎn)物呈綠色顆粒，二者主要表達在間質(zhì)細胞和精原細胞的胞質(zhì)。Western blot檢測結(jié)果顯示與青年對照組相比，自然衰老組Caspase-3、Cytc、BAX、DR6表達明顯增加(P<0.01)，14-3-3σ表達明顯減少(P<0.01)；何首烏飲用藥組與自然衰老組大鼠比較Caspase-3、Cytc、BAX、DR6表達量明顯減少(P<0

9、.01)，14-3-3σ表達量明顯增加(P<0.01)；用藥組間相比，何首烏飲1組14-3-3σ表達量明顯高于何首烏飲2組(P<0.01)，何首烏飲1組BAX、Caspase-3、DR6、Cytc表達量明顯低于何首烏飲2組(P<0.01或P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.何首烏飲能夠降低衰老標志物β-半乳糖苷酶的表達。
　　2.何首烏飲可以明顯減少自然衰老大鼠睪丸生精細胞的凋亡。
　　3.在睪丸組織中受何首烏