石杉堿甲對D-半乳糖衰老大鼠肝臟細胞凋亡與自體吞噬的作用機制研究.pdf

1、[背景]
　　隨著人們生活水平的提高，人口老齡化逐漸加速，已成為當今社會面臨的重要挑戰(zhàn)。因此，對衰老機制及衰老相關(guān)疾病的研究越發(fā)重要，近年來得到廣泛的重視和關(guān)注。目前衰老的確切機制尚不清楚。D-半乳糖可誘導(dǎo)機體氧化應(yīng)激損傷，模擬自然衰老進程，是目前衰老研究常用的動物模型。石杉堿甲是一種可逆的、選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEI)，目前國內(nèi)臨床廣泛應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的治療，如阿爾茨海默病。然而，關(guān)于石杉堿甲能否改善D-半乳糖所

2、致的肝臟衰老及其在衰老肝臟細胞凋亡與自體吞噬中的作用，目前尚未見研究。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是機體重要的細胞因子，可通過血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2/Flk-1)，調(diào)節(jié)下游的PI3K/Akt/GSK-3β信號通路，參與細胞凋亡的調(diào)控。同時，PI3K/Akt/mTOR信號通路與自體吞噬密切相關(guān)，GSK-3β亦可參與調(diào)節(jié)mTOR活性。細胞凋亡與自體吞噬兩條信號通路可被這些共同的因子調(diào)控，這使兩者之間存在密切聯(lián)系。因此，我們

3、設(shè)想:石杉堿甲能通過Flk-1調(diào)節(jié)下游的PI3K/Akt/GSK-3β/mTOR信號通路，參與調(diào)節(jié)D-半乳糖大鼠肝臟的細胞凋亡與自體吞噬，進而保護肝臟，延緩衰老。
　　[目的]
　　1.建立D-半乳糖大鼠衰老模型，通過血清肝功能、肝臟免疫組織化學染色及電鏡檢測，評估D-半乳糖能否誘導(dǎo)肝臟損傷及衰老。在此基礎(chǔ)上，進一步探討石杉堿甲對D-半乳糖所致肝臟損傷及衰老的作用。
　　2.比較各組肝臟凋亡指數(shù)(AI)及caspase

4、3表達，探討石杉堿甲對衰老大鼠肝臟細胞凋亡的影響。同時比較各組肝臟Flk-1(A-3)、p-Flk-1(tyr996)-R、p-GSK-3β(Ser9)表達水平，進一步探討石杉堿甲能否通過Flk-1/Akt/GSK-3β信號通路調(diào)節(jié)肝臟細胞凋亡。
　　3.比較各組肝臟p-mTOR(S2448)、LC3B、Atg7的表達，探討石杉堿甲對衰老大鼠肝臟自體吞噬的影響。綜合分析肝臟p-GSK-3β(Ser9)、p-mTOR(S2448)表

5、達情況，進一步探討石杉堿甲對衰老肝臟自體吞噬調(diào)節(jié)的可能機制。
　　[方法]
　　1.2月齡清潔級雄性Sprague Dawley大鼠36只，按隨機數(shù)字表法平均分為三組:
　　(1)D-半乳糖組（D-半乳糖300mg/Kg/d皮下注射）;
　　(2)D-半乳糖+石杉堿甲組（D-半乳糖300mg/Kg/d+石杉堿甲0.1mg/Kg/d聯(lián)合皮下注射）;
　　(3)對照組（生理鹽水皮下注射）。每組各12只大鼠，實驗

6、時間持續(xù)8周。第8周末，每組各取3只大鼠，進行BrdU標記。
　　2.留取血清，全自動生化分析儀測定肝酶指標，評估肝功能。免疫組織化學染色測定肝臟SA-β-Gal、BrdU表達，比較三組肝臟衰老情況。電鏡下觀察三組肝臟細胞顯微結(jié)構(gòu)。
　　3.TUNEL染色檢測肝臟細胞凋亡情況，計算三組AI，統(tǒng)計學比較差異。免疫組織化學染色測定肝臟Flk-1(A-3)、p-Flk-1(tyr996)-R、p-GSK-3β(Ser9)表達，We

7、stern Blot分析測定肝臟caspase3表達，利用圖像分析軟件對結(jié)果進行半定量測定，三組計量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學比較分析。
　　4.免疫組織化學染色測定肝臟p-mTOR(S2448)、LC3B、Atg7表達，Western Blot分析測定肝臟p-mTOR(S2448)表達，利用圖像分析軟件進行半定量分析，三組計量數(shù)據(jù)行統(tǒng)計學比較。
　　[結(jié)果]
　　1.2月齡雄性SD大鼠皮下注射D-半乳糖8周后，血清AST、TBI

8、L、DBIL及ALP水平顯著高于對照組(AST、DBIL:P＜0.01; TBIL、ALP:P＜0.001)。石杉堿甲可有效抑制D-半乳糖導(dǎo)致的AST、TBIL升高（P＜0.05），而對ALP、DBIL作用不明顯。同時，與對照組相比，D-半乳糖+石杉堿甲組的AST、TBIL及ALP水平仍較高（AST、ALP:P＜0.05;TBIL:P＜0.01）。三組間ALT水平無明顯差異（F=0.0227，P=0.978）。這提示，石杉堿甲可一定程度

9、上減輕D-半乳糖所致肝損傷，但不能完全逆轉(zhuǎn)。
　　2.免疫組織化學染色顯示，與對照組相比，D-半乳糖組肝臟SA-β-Gal表達明顯增加，BrdU陽性細胞顯著減少。D-半乳糖+石杉堿甲組SA-β-Gal表達情況與對照組相似，較D-半乳糖組明顯降低;BrdU陽性細胞較D-半乳糖組明顯增多，但仍低于對照組。這說明，D-半乳糖可導(dǎo)致肝細胞衰老及復(fù)制能力降低，石杉堿甲干預(yù)可有效改善。
　　3.電鏡顯示，D-半乳糖組有大量脂滴沉積，線粒

10、體腫脹、嵴減少，溶酶體內(nèi)見脂褐素沉積，支持肝臟存在衰老相關(guān)變化。D-半乳糖+石杉堿甲組腫脹線粒體、脂滴明顯減少，并見大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，提示石杉堿甲有助于清除受損線粒體及脂滴，促進細胞合成功能，延緩衰老。
　　4.TUNEL染色顯示，D-半乳糖組見滿視野凋亡細胞（核棕黃色、碎片、皺縮），石杉堿甲干預(yù)后凋亡細胞明顯減少，對照組僅有少量凋亡細胞。D-半乳糖組AI(％)為73.150±2.635，明顯高于對照組(2.117±0.651)及D

11、-半乳糖+石杉堿甲組(13.884±1.547)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。D-半乳糖+石杉堿甲組AI仍高于對照組(P＜0.05)。Western Blot分析顯示， D-半乳糖組肝臟caspase3表達明顯高于對照組(P＜0.001)。石杉堿甲干預(yù)可有效抑制caspase3表達(P＜0.01)，但仍高于對照組(P＜0.01)。這說明，石杉堿甲可改善D-半乳糖所致的細胞凋亡，但尚不能完全逆轉(zhuǎn)。
　　5.免疫組織化學染色顯示

12、，D-半乳糖+石杉堿甲組Flk-1(A-3)、p-Flk-1(tyr996)-R表達明顯高于其他兩組(P＜0.05)，而對照組與D-半乳糖組之間沒有統(tǒng)計學差異(Flk-1(A-3): P=0.999;p-Flk-1(tyr996)-R: P=0.122)。 p-GSK-3β(Ser9)的表達在三組間有明顯差異（ANOVA，F(xiàn)=1026.676，P＜0.001），其中以D-半乳糖+石杉堿甲組表達最高，對照組表達居中，D-半乳糖組表達最低（

13、Holm-Sidak兩兩比較，P＜0.001）。這提示，石杉堿甲對衰老肝臟細胞凋亡的抑制，可能與Flk-1/Akt/GSK-3β信號通路的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。
　　6.免疫組織化學染色顯示，D-半乳糖組肝臟p-mTOR(S2448)表達明顯高于對照組(P＜0.01);D-半乳糖+石杉堿甲組表達較D-半乳糖組明顯下降（P＜0.05），與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P=0.731)。三組LC3B表達有顯著差異(ANOVA，F(xiàn)=38.4，P＜0.

14、001)。D-半乳糖組LC3B表達低于對照組(P＜0.001)及D-半乳糖+石杉堿甲組(P＜0.01)，石杉堿甲干預(yù)可促進LC3B表達，但仍低于對照組(P＜0.01)。三組Atg7表達無統(tǒng)計學差異（ANOVA，F(xiàn)=2.747，P=0.117），但平均光密度值顯示對照組Atg7表達相對最高，而D-半乳糖組最低。WesternBlot分析顯示，D-半乳糖組肝臟p-mTOR(S2448)表達明顯高于對照組(P＜0.001)。石杉堿甲干預(yù)可有效

15、抑制p-mTOR(S2448)表達(P＜0.01)，但仍高于對照組（P＜0.01）。可見，D-半乳糖可抑制衰老肝臟的自體吞噬，石杉堿甲可一定程度上逆轉(zhuǎn)該作用，促進自體吞噬。
　　7.綜合分析三組肝臟p-GSK-3β(Ser9)及p-mTOR(S2448)表達情況，推斷石杉堿甲對mTOR信號通路及自體吞噬的調(diào)節(jié)過程很復(fù)雜，不僅僅通過Flk-1/Akt/GSK-3β通路進行，可能與其他信號通路相關(guān)，且這些調(diào)節(jié)通路共同作用，最終表現(xiàn)為對

16、自體吞噬的促進。
　　[結(jié)論]
　　1.D-半乳糖皮下注射SD大鼠8周，可誘導(dǎo)肝臟損傷、肝細胞衰老及復(fù)制能力降低。石杉堿甲干預(yù)可減輕D-半乳糖所致的肝臟損傷，延緩衰老。
　　2.D-半乳糖可促進衰老肝臟的細胞凋亡，石杉堿甲干預(yù)可有效改善細胞凋亡，但不能完全逆轉(zhuǎn)。
　　3.石杉堿甲可能通過Flk-1/Akt/GSK-3β信號通路，參與調(diào)控衰老肝臟細胞凋亡。
　　4.D-半乳糖可抑制衰老肝臟的自體吞噬，石杉堿甲