血小板膜糖蛋白Ibα Kozak序列-5T-C基因多態(tài)性與冠心病關(guān)系的初步研究.pdf

1、目的與背景:冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病，CoronaryArteryDisease，CAD)是目前臨床上最為多見(jiàn)的心血管內(nèi)科疾病之一，血栓形成是導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈閉塞的主要形式，在血栓形成過(guò)程中血小板起著重要作用。血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)是一種存在于血小板質(zhì)膜表面的糖蛋白。GPIb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合物是血小板膜上主要的糖蛋白之一，在血小板粘附到血管壁的過(guò)程中起著重要的作用。GPIbα是血小板膜上含量最多的糖蛋白，是GP

2、Ib-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合物組成的關(guān)鍵部分，是血管性血友病因子(vonWilebrandFactor，vWF)的主要受體，能和己結(jié)合在膠原上的vWF結(jié)合，并且含有凝血酶的高親和力結(jié)合位點(diǎn)。目前臨床研究GPIb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合物基因多態(tài)性的焦點(diǎn)是GPIbα的基因多態(tài)性。GPIbα基因已證實(shí)至少有三種多態(tài)性，Kozak序列-5T/C多態(tài)性、VNTR多態(tài)性和HPA-2a/2b多態(tài)性，其中Kozak序列-5T/C多態(tài)性可影響基因的表達(dá)水平。 近年，國(guó)

3、外有研究結(jié)果證實(shí)GPIbαKozak序列-5T/C基因多態(tài)性與冠心病、心肌梗死有關(guān)，但也有不同的報(bào)道，其與冠心病的關(guān)系仍在爭(zhēng)論之中。本研究旨在運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(PolymeraseChainReactionandRestrictionFragmentLengthPolymorphism，PCR-RFLP)了解該基因多態(tài)性在中國(guó)漢族人群中的分布，并探討其與冠心病、冠狀動(dòng)脈病變范圍以及急性冠狀動(dòng)脈綜合征(Acute

4、CoronarySyndrome，ACS)等的關(guān)系。 材料與方法: 1.研究對(duì)象均為本院2002年12月～2005年5月間住院行選擇性冠狀動(dòng)脈造影的患者，共196例。 根據(jù)冠脈造影結(jié)果分為冠心病組和對(duì)照組。冠心病組105例(男性76例，女性29例)，平均年齡64.64±9.54歲，均符合1979年WHO關(guān)于缺血性心臟病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并全部經(jīng)選擇性冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)，以左主干、左前降支、左回旋支、右冠狀動(dòng)脈及主要分支中

5、任何一支血管狹窄程度≥50％為陽(yáng)性。對(duì)照組91例(男性50例，女性41例)，平均年齡59.02±10.73歲，冠狀動(dòng)脈造影為陰性。 同時(shí)根據(jù)臨床情況分為ACS組和非ACS組。ACS組59例(男性40例，女性19例)，其中急性心肌梗死18例，不穩(wěn)定心絞痛41例，平均年齡64.12±9.51歲；非ACS組128例(男性79例，女性49例)，其中冠脈造影陰性患者86例，穩(wěn)定型心絞痛患者42例，平均年齡60.60±10.87歲。

6、 所有研究對(duì)象均來(lái)自浙江地區(qū)漢族人群，無(wú)血緣關(guān)系。 2.方法 2.1.臨床資料的收集所有受試者均詳細(xì)詢問(wèn)有無(wú)吸煙史、高血壓病史、糖尿病史、并檢測(cè)血脂等生化指標(biāo)和凝血酶原時(shí)間(PT和INR值)。應(yīng)用Judkins技術(shù)經(jīng)股動(dòng)脈或橈動(dòng)脈行冠狀動(dòng)脈造影，由2名有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師分析造影結(jié)果，以冠狀動(dòng)脈及主要分支中任何一支血管狹窄程度≥50％為陽(yáng)性。 2.2.基因組DNA的提取外周血經(jīng)離心去上清后，置于-72℃冷凍保存。采用鹽析

7、法抽提外周血基因組DNA。加TE溶解于-72℃凍存?zhèn)溆谩?2.3.PCR-RFLP技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)使用引物為：上游5'-GGGAGTAGGGAGGACAGGAG-3'，下游5'-AGTGTAAGGCATCAGGGTTG-3'(由上海生物工程公司合成)。PCR反應(yīng)體系25ul，包括：200ng的DNA模板，10umol/L的上下游引物、200umol/L的dNTP、1.5mmol/L的MgCl2、10×buffer各1μl，以及1

8、.5U的TaqDNA聚合酶。采用降落PCR，反應(yīng)條件為：先于95℃預(yù)變性5min，然后95℃變性1min，64℃退火1min，72℃延伸2min，共2個(gè)循環(huán)后，每個(gè)循環(huán)的退火溫度依次降落1℃，直至59℃，再以59℃為退火溫度重復(fù)循環(huán)30次，最后以72℃延伸10min結(jié)束。PCR產(chǎn)物用能識(shí)別T等位基因的限制性內(nèi)切酶AvaⅡ消化。酶切體系10μl，包括5μl的PCR產(chǎn)物，限制型內(nèi)切酶AvaⅡ5U及酶切緩沖液。酶切體系在37℃水浴過(guò)夜。PCR

9、及酶切產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠電泳—溴化乙錠(EB)染色法進(jìn)行檢測(cè)分型。用紫外凝膠成像系統(tǒng)判定結(jié)果。 2.4.GPIbα的Kozak序列-5T/C基因多態(tài)性分析PCR擴(kuò)增片段大小為348bp，經(jīng)能識(shí)別T等位基因的限制性內(nèi)切酶AvaⅡ消化，形成129bp和219bp的兩個(gè)片斷。各基因型區(qū)別標(biāo)準(zhǔn)如下：CC基因型(348bp)，CT基因型(129bp，219bp，348bp)，TT基因型(129bp，219bp)。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

10、基因型和等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)。研究對(duì)象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度、基因型和等位基因分布頻率的組間比較采用四格表χ2檢驗(yàn)和R×C列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)，對(duì)樣本數(shù)小于40的計(jì)數(shù)資料用四格表確切概率法，一般臨床資料中計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有顯著性。用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 結(jié)果1.在冠脈造影總體人群中GPIbαKozak-5T/C基因多態(tài)性的

11、分布在冠脈造影的總體人群中，Kozak-5T/C基因型的分布為：TT型51.5％，CT型40.3％，CC型8.2％；T等位基因的分布頻率為71.7％，C等位基因?yàn)?8.3％。基因型在人群中的分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.004，P=0.998)。冠心病組和對(duì)照組中均可觀察到三種基因型。 2.一般臨床資料和冠心病危險(xiǎn)因素的比較冠心病組和對(duì)照組之間性別、吸煙史、高血壓病史、糖尿病史、和血脂水平等無(wú)顯著性差異(P

12、＞0.05)；冠心病組平均年齡高于對(duì)照組，差異有顯著性(P＜0.05)。ACS組和非ACS組之間性別、吸煙史、高血壓病史、糖尿病史、和血脂水平等無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；ACS組平均年齡高于非ACS組，差異有顯著性(P＜0.05)。 3.Kozak-5T/C基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系CC、CT、TT基因型的分布頻率在冠心病組中分別為9.5％、41.9％和48.6％，在對(duì)照組中分別為6.6％、38.5％和54.9％，兩組之間無(wú)顯

13、著性差異(χ2=1.041，P=0.594)。C和T等位基因的分布頻率在冠心病組中為30.5％和69.5％，在對(duì)照組中為25.8％和74.2％，兩組之間無(wú)顯著性差異(χ2=1.041，P=0.594)。 4.Kozak-5T/C基因多態(tài)性與冠心病病變程度的關(guān)系CC、CT、TT基因型的分布頻率在冠心病單支病變亞組中分別為4.8％、40.5％和54.8％，在多支病變亞組中分別為12.7％、42.9％和44.4％，兩組之間無(wú)顯著性差異

14、(χ2=2.253，P=0.324)。C和T等位基因的分布頻率在單支病變亞組中為25.0％和75.0％，在多支病變亞組中為34.1％和65.9％，兩組之間無(wú)顯著性差異(χ2=1.981，P=0.159)。 5.Kozak-5T/C基因多態(tài)性與ACS的關(guān)系CC、CT、TT基因型的分布頻率在ACS組中分別為8.5％、40.7％和50.8％，在非ACS組中分別為7.8％、39.1％和53.1％，兩組之間無(wú)顯著性差異(χ2=0.089，

15、P=0.957)。C和T等位基因的分布頻率在ACS組中為28.8％和71.2％，在非ACS組中為27.3％和72.7％，兩組之間無(wú)顯著性差異(χ2=0.087，P=0.768)。 將ACS組中年齡60周歲以下的亞組與非ACS組之間進(jìn)行比較，各基因型及等位基因的分布頻率在兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P＞0.05)。 6.Kozak-5T/C基因多態(tài)性與INR值的關(guān)系對(duì)CC、CT和TT三種基因型之間的凝血酶原時(shí)間INR值進(jìn)行

16、比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論:中國(guó)漢族人群中存在Kozak-5T/C基因多態(tài)性，C和T等位基因頻率分別為28.3％和71.7％。Kozak-5T/C基因多態(tài)性的CC、CT、TT基因型和T、C等位基因的分布頻率在冠心病組和對(duì)照組之間、單支病變亞組和多支病變亞組之間、ACS組和非ACS組之間、早發(fā)ACS亞組和非ACS組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。GPIbαKozak序列-5T/C基因多態(tài)性與CAD和ACS之間無(wú)明確