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文檔簡介
1、目的:結直腸癌是常見的惡性腫瘤,其預后較差,生存率低,其中結直腸癌的浸潤轉移是術后復發(fā)和導致患者死亡的重要原因。結直腸癌轉移是一個多因素、多階段、多步驟的復雜生物學過程,癌細胞對腫瘤內部缺氧微環(huán)境的耐受與適應是發(fā)生轉移的基礎。轉錄因子缺氧誘導因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1alpha,HIF-1α)作為感受不同氧環(huán)境下氧分壓的中樞調控子,除調節(jié)細胞內氧穩(wěn)態(tài)外,尚能夠調節(jié)相關基因的轉錄活性,積極參與腫瘤的侵襲、
2、轉移等病理生理過程。因其作用機制復雜,目前仍缺乏深入了解。為此,本課題在既往對結直腸癌侵襲轉移研究的基礎上,探討腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中HIF-1α與FasL的表達,以期進一步了解結直腸癌的侵襲轉移機制,為臨床防治提供新的靶點與理論依據(jù)。 方法: 1.采用分子克隆方法,將我室已構建的FasL-pcDNA3.1(+)質粒與pcDNA3.1(-)質粒進行重組,得到新的FasL-pcDNA3.1(-)質粒并進行鑒定。通過脂質體轉染法
3、將空質粒、FasL-pcDNA3.1(+)與FasL-pcDNA3.1(-)質粒分別轉染人直腸癌HR-8348細胞,構建侵襲力不同的結直腸癌細胞HR-8348L、HR-8348F和HR-8348As并加以鑒定;以未轉染細胞HR-8348B為空白對照,觀察細胞形態(tài),檢測各組細胞的侵襲能力與增殖速度。 2.采用化學缺氧法構建四組直腸癌HR-8348細胞缺氧模型,免疫細胞化學方法檢測各組細胞缺氧12h后HIF-1α表達水平,計算陽性表
4、達百分率;Westernblot方法定量檢測缺氧0h、6h、12h及24h各組細胞內HIF-1α的表達;并在缺氧12h時相下,應用流式細胞儀測定各組細胞周期的分布,MTT法測定各組細胞增殖能力的改變,TUNEL法測定各組細胞凋亡狀況。 3.采用免疫組織化學方法,對120例結直腸癌組織及癌旁組織、30例結腸腺瘤組織及28例結直腸癌肝轉移組織中HIF-1α與FasL,的表達情況進行檢測,并分析HIF-1α表達與結腸癌臨床病理特征和F
5、asL水平之間的關系。 結果: 1.新構建質粒FasL-pcDNA3.1(-)符合要求,F(xiàn)asL酶切片斷及PCR片斷大小正確,測序正確率為99.2%;各質粒轉染成功,RT-PCR方法可分別自HR-8348F細胞和HR-8348AS細胞中得到FasL和As-FasL片斷;倒置顯微鏡下觀察各組細胞,見HR-8348F細胞異型性更明顯;單層細胞體外侵襲實驗見HR-8348F細胞穿透Transwell濾膜的細胞數(shù)目為12.930
6、±2.434,顯著多于HR-8348B、HR-8348L和HR-8348As細胞(分別為8.133±1.959,7.670±2.093和7.870±1.685)(P<0.05);HR-8348B、HR-8348L、HR-8348F和HR-8348AS細胞的群體倍增時間分別為28.3h、41.0h、24h和35.4h。 2.缺氧12h后,HR-8348F細胞HIF-1α蛋白陽性率為76.0%,顯著高于HR-8348B、HR-834
7、8L和HR-8348As細胞(分別為48.5%,43.0%和39.5%)(P<0.05),而后三組細胞間無顯著性差異(P>0.05)。Westernblot檢測示HIF-1α蛋白于120KD處顯色;比較不同缺氧時相各組細胞內HIF-1α的表達水平,缺氧0h與6h,各組樣品中HIF-1α表達微量;缺氧12h,HR-8348F細胞內HIF-1α水平較0h和6h時明顯增高(P<0.05),而HR-8348B、HR-8348L及HR-8348A
8、s細胞內HIF-1α表達與6h時無明顯變化(P>0.05);缺氧24h,HR-8348F細胞內HIF-1α表達仍處于較高水平,但與缺氧12h表達量比較差別不顯著(P>0.05),HR-8348B、HR-8348L及HR-8348As細胞內HIF-1α表達水平則較缺氧12h略有下降,但不具備統(tǒng)計學意義(P>0.05);組間比較,缺氧0h、6h時各組細胞HIF-1α蛋白水平無顯著性差異(P>0.05),缺氧12h、24hHR-8348F細胞
9、HIF-1α水平顯著高于HR-8348B、HR-8348L及HR-8348As細胞(P<0.01)。測定缺氧狀態(tài)下的細胞生物學特性,見HR-8348F細胞的增殖指數(shù)(60.43±3.61)顯著高于HR-8348B、HR-8348L和HR-8348As細胞(40.01±3.22,41.30±3.96和35.87±4.28)(P<0.05),增殖抑制率和凋亡指數(shù)(17.30±2.08和13.10±1.06)顯著低于HR-8348B、HR-8
10、348L、HR-8348As細胞(33.70±4.56和21.60±1.33,34.20±4.12和20.10±1.17,38.00±4.79和23.90±1.25)(P<0.05)。 3.HIF-1α陽性率在結直腸癌旁粘膜中為5.8%(7/120),在結腸腺瘤組織中為20.0%(6/30),在結直腸癌原發(fā)灶和轉移灶中分別為71.7%(86/120)和89.3%(25/28);癌原發(fā)灶和肝轉移灶中HIF-1α的表達水平顯著高于腺
11、瘤和癌旁組織(P<0.01),腺瘤組織中HIF-1α水平亦高于癌旁粘膜組織(P<0.05),而癌原發(fā)灶與肝轉移灶中HIF-1α水平無明顯差異(P>0.05)。FasL的陽性表達率在癌旁粘膜、結腸腺瘤、癌原發(fā)灶和肝轉移灶中分別為15.0%(18/120)、23.3%(7/30)、69.2%(83/120)和100.0%(28/28);癌原發(fā)灶和轉移灶中FasL的表達水平明顯高于腺瘤和癌旁組織(P<0.01),而腺瘤和癌旁組織中、癌原發(fā)灶與
12、肝轉移灶中FasL水平均無顯著性差異(P>0.05)。結直腸癌原發(fā)灶中HIF-1α的表達水平與患者性別、年齡、病理組織學類型及分化程度無關(P>0.05),而與區(qū)域淋巴結轉移狀況及Dukes分期密切相關(P<0.05)。發(fā)生肝轉移患者的癌原發(fā)灶中HIF-1α和FasL陽性表達率分別為92.9%(26/28)和85.7%(24/28),與無肝轉移組(分別為65.2%,60/92和64.1%,59/92)相比均差異顯著(P<0.01);HI
13、F-1α與FasL的表達強度有等級相關性(r=0.924,JP<0.01)。 結論: 1.應用分子克隆技術將正義FasL片斷轉染入結直腸癌細胞內可構建具有高侵襲力的細胞,結直腸癌細胞內FasL的表達強度與其侵襲能力呈正相關; 2.結直腸癌細胞內FasL表達增強可促進缺氧狀態(tài)下細胞HIF-1α表達增高,促進細胞對微環(huán)境缺氧的適應,導致細胞的增殖加速,凋亡減少,侵襲能力進一步增強; 3.結直腸癌組織中HIF-
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