MORC2在肝細(xì)胞脂肪變性中的作用與機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)由于其廣大的患病人群以及進(jìn)展為慢性肝功能衰竭和肝癌等終末期肝病的可能性，已被人們高度關(guān)注。對于NAFLD的發(fā)病機(jī)制，目前仍未完全闡明，較為公認(rèn)的是“二次打擊”理論:第一次打擊主要指肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，使肝細(xì)胞更容易受到細(xì)胞內(nèi)外各種損傷因子的攻擊;第二次打擊是肝細(xì)胞內(nèi)蓄積過多的脂類產(chǎn)生脂毒性，造成膜結(jié)構(gòu)、DNA與細(xì)胞器等損傷

2、，最終使肝細(xì)胞死亡。
　　肝臟脂肪代謝紊亂是NAFLD發(fā)生的病理基礎(chǔ)。在肝細(xì)胞脂代謝穩(wěn)態(tài)的維持中，核轉(zhuǎn)錄因子在其中發(fā)揮重要作用。核轉(zhuǎn)錄因子MORC2（Microrchidia family CW-typezinc finger2，也稱ZCWCC1）蛋白由970個氨基酸殘基組成，其中的核定位序列可使成熟的MORC2蛋白主要定位于胞核，為其調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄提供了細(xì)胞定位的前提;序列中鋅指結(jié)構(gòu)有利于MORC2結(jié)合DNA片段，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

3、。另外，MORC2蛋白含有特征性GHKL-ATPase保守結(jié)構(gòu)域，可參與異染色質(zhì)形成，通過封閉基因轉(zhuǎn)錄起始部位達(dá)到使基因沉默的作用。MORC2也可與組蛋白去乙?；?(HDAC4)形成蛋白復(fù)合物，通過表觀遺傳的方式發(fā)揮負(fù)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。現(xiàn)已鑒定出了第一個直接受MORC2負(fù)性調(diào)控的下游基因CAIX，人們對MORC2作為抑制性核轉(zhuǎn)錄因子的研究將繼續(xù)深入。
　　少量表達(dá)于胞漿中的MORC2也可發(fā)揮與調(diào)控轉(zhuǎn)錄的功能無關(guān)的效應(yīng):在前脂肪細(xì)胞

4、向脂肪細(xì)胞分化時，胞質(zhì)中的MORC2含量上升，且可與ATP-檸檬酸裂解酶相互作用，促進(jìn)后者的活化。ATP-檸檬酸裂解酶是催化乙酰輔酶A形成的重要分子，而后者則是糖、脂等能量代謝中的核心。由于前脂肪細(xì)胞在分化過程中發(fā)生了成脂基因激活、甘油三酯(triglyceride，TG)蓄積等與肝細(xì)胞脂肪變性類似的分子事件，故上述發(fā)現(xiàn)為本課題的研究提供了至關(guān)重要的線索和依據(jù)。
　　為此，我們嘗試研究MORC2在肝細(xì)胞脂肪變性過程中是否發(fā)生含量變

5、化、是否通過調(diào)控脂代謝相關(guān)基因進(jìn)而參與了脂肪代謝穩(wěn)態(tài)失衡和脂肪變性的發(fā)生。本研究為進(jìn)一步闡明“第一次打擊”及NAFLD的發(fā)病機(jī)理提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及思路。
　　方法：
　　1.構(gòu)建永生化人肝細(xì)胞株L02（以下簡稱L02肝細(xì)胞）的脂肪變性模型，并使用ORO染色及細(xì)胞TG含量檢測對模型進(jìn)行鑒定;
　　2.免疫熒光及Western Blotting技術(shù)檢測MORC2在L02肝細(xì)胞脂肪變性誘導(dǎo)過程中的核漿蛋白水平變化;

6、　　3.檢測MORC2在L02肝細(xì)胞脂肪變性過程中的蛋白合成與降解水平
　　3.1.qRT-PCR檢測L02肝細(xì)胞脂肪變性誘導(dǎo)前后morc2的mRNA水平變化;
　　3.2.UbiPred網(wǎng)站及UbiProber軟件預(yù)測MORC2蛋白氨基酸序列上可能的泛素化修飾位點(diǎn);
　　3.3.Western Blotting檢測增強(qiáng)或抑制泛素-蛋白酶體途徑后的MORC2蛋白水平;
　　4.構(gòu)建慢病毒并轉(zhuǎn)染L02肝細(xì)胞，使其穩(wěn)

7、定過表達(dá)MORC2;并使用WestemBlotting對過表達(dá)效果進(jìn)行鑒定;
　　5.ORO染色及TG含量測定比較過表達(dá)MORC2前后L02肝細(xì)胞的脂肪變性程度;
　　6.基因表達(dá)譜芯片篩選MORC2可能影響的脂代謝相關(guān)基因或通路;
　　7.Western Blotting檢測L02肝細(xì)胞中p53蛋白水平在過表達(dá)MORC2前后的變化;
　　8.pCMV6-XL5-p53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L02肝細(xì)胞以過表達(dá)p53，并使用W

8、estern Blotting進(jìn)行效果鑒定;
　　9.ORO染色及TG含量測定觀察MORC2過表達(dá)后，再過表達(dá)p53時，L02肝細(xì)胞的脂肪變性程度;
　　10.使用StepOne軟件、SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.L02肝細(xì)胞脂肪變性模型的建立與鑒定
　　ORO染色及TG含量測定可見對照組細(xì)胞脂肪含量極少，而脂肪變性誘導(dǎo)組細(xì)胞脂肪蓄積程度明顯，且具有時間依賴性;
　　2.免

9、疫熒光及Western Blotting檢測MORC2在L02肝細(xì)胞脂肪變性誘導(dǎo)過程中的蛋白水平變化
　　MORC2蛋白主要表達(dá)在L02肝細(xì)胞核內(nèi)，胞漿表達(dá)少，在脂肪變性誘導(dǎo)的前12h，MORC2的核、漿含量均無顯著變化;在誘導(dǎo)12h后，胞核中MORC2的含量出現(xiàn)明顯下降，而胞漿中的含量無明顯變化;
　　3.MORC2在L02肝細(xì)胞脂肪變性過程中的蛋白水平下降與泛素-蛋白酶體途徑有關(guān)
　　3.1.qRT-PCR檢測中發(fā)

10、現(xiàn)，相比于對照組，脂肪變性誘導(dǎo)組細(xì)胞的morc2 mRNA水平并無明顯變化;
　　3.2.UbiPred網(wǎng)站UbiProber軟件預(yù)測結(jié)果顯示，在MORC2的氨基酸序列中存在9個可能性在80％以上的泛素化修飾位點(diǎn);
　　3.3.加用NEM提取蛋白可使胞核中MORC2蛋白含量降低，但胞漿中MORC2無明顯變化;
　　3.4.使用MG-132抑制蛋白酶體可解除MORC2在L02脂肪變性過程中的下降趨勢;
　　4.穩(wěn)定

11、過表達(dá)MORC2的L02肝細(xì)胞建立與鑒定
　　4.1.將MORC2過表達(dá)載體用ECoRV進(jìn)行酶切鑒定、測序及比對結(jié)果顯示質(zhì)粒序列無誤;
　　4.2.Western Blotting檢測中，可見L02-MORC2組核漿蛋白及總蛋白中的MORC2蛋白含量均較L02-WT組及L02-ctrl組明顯上調(diào);
　　5.過表達(dá)MORC2可減輕L02肝細(xì)胞的脂肪變性
　　ORO染色及TG含量測定結(jié)果顯示，脂肪變性誘導(dǎo)后，L02-

12、MORC2組細(xì)胞的脂肪蓄積程度較L02-WT組及L02-ctrl組明顯減輕;
　　6.篩選MORC2可能影響的脂代謝相關(guān)基因或通路
　　熱圖結(jié)果顯示，在L02-MORC2組與L02-ctrl組之間的基因表達(dá)譜發(fā)生了明顯變化;GO分析與Pathway分析結(jié)果顯示，MORC2的功能主要與結(jié)合蛋白、核酸等大分子有關(guān)，也可負(fù)性調(diào)控多種生物學(xué)過程，MORC2可能調(diào)控的通路包括與脂肪代謝密切相關(guān)的p53通路;
　　7.L02肝細(xì)胞

13、中p53分子蛋白水平在過表達(dá)MORC2后降低
　　在對P53蛋白的Western Blotting檢測中，當(dāng)L02肝細(xì)胞過表達(dá)MORC2后，P53蛋白水平發(fā)生了明顯下降;
　　8.過表達(dá)p53的效果鑒定
　　Western Blotting檢測顯示:在轉(zhuǎn)染p53過表達(dá)質(zhì)粒后，P53的蛋白水平較轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒時明顯升高，且L02-MORC2組中p53的表達(dá)水平比L02-WT組及L02-ctrl組略低。
　　9.ORO

14、染色及細(xì)胞TG含量測定均顯示過表達(dá)p53可部分解除MORC2減輕L02肝細(xì)胞脂肪變性的效應(yīng)
　　由ORO及細(xì)胞TG含量測定可見:在轉(zhuǎn)染p53過表達(dá)質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒時，L02-MORC2組細(xì)胞的脂肪蓄積程度均較L02-WT與L02-ctrl組減輕。但在過表達(dá)p53后，MORC2的這種減輕L02肝細(xì)胞脂肪變性的效應(yīng)得到了一定程度的削弱。
　　結(jié)論：
　　1.在L02肝細(xì)胞脂肪變性過程中，胞核中的MORC2蛋白含量發(fā)生了顯著降

15、低;而MORC2的蛋白合成水平未發(fā)生明顯變化，此時MORC2主要在泛素-蛋白酶體途徑中進(jìn)行降解;
　　2.過表達(dá)MORC2可減輕L02肝細(xì)胞在脂肪變性誘導(dǎo)后的細(xì)胞內(nèi)TG蓄積，提示MORC2蛋白可在脂肪變性時對L02肝細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用;
　　3.L02肝細(xì)胞中p53通路水平在過表達(dá)MORC2后發(fā)生了下調(diào)，p53蛋白水平降低;且過表達(dá)p53后，過表達(dá)MORC2減輕L02肝細(xì)胞脂肪變性的效應(yīng)得到了削弱，提示MORC2對脂肪變性的保