百草枯中毒大鼠腎組織中HGF與TGF-β-,1-的表達(dá)及促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的治療干預(yù)研究.pdf

1、目的：百草枯(paraquat，PQ)，是目前世界范圍內(nèi)使用廣泛的有機(jī)雜環(huán)類接觸性除草劑，隨著其在我國(guó)農(nóng)業(yè)上的廣泛應(yīng)用，PQ中毒也日趨增多。PQ對(duì)人畜均有較強(qiáng)毒性，經(jīng)皮膚接觸、呼吸道及消化道進(jìn)入體內(nèi)，造成急性中毒。中毒致死劑量小，病程進(jìn)展快，且尚缺乏特效解毒劑及有效降低毒物毒性的治療手段，臨床上病死率高。PQ以原形的形式主要經(jīng)腎臟排泄，這也是導(dǎo)致腎臟損傷的主要原因。目前PQ經(jīng)腎臟排泄的確切機(jī)制及PQ中毒致腎組織損傷機(jī)制均尚不完全明確。本

2、研究通過(guò)觀察PQ染毒大鼠腎組織病理變化，測(cè)定血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)的變化，腎組織勻漿丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxidedismlnase，SOD)及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSH-Px)的活力，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte growth factor，HGF)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Trarlsform

3、ing growth factor-β1，TGF-β1)在PQ中毒大鼠腎組織中的表達(dá)及相互作用，以及促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(Hepatocyte Growth-promoting Factors，pHGF)對(duì)上述指標(biāo)的干預(yù)影響，進(jìn)一步探討PQ中毒致腎損傷的機(jī)制及促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)PQ中毒大鼠腎損傷的預(yù)防及治療作用。 方法：選擇健康成年SD(Sprague-Dawley)大鼠108只，隨機(jī)分為三組：①對(duì)照組(A組)36只；②染毒組(B組)3

4、6只；③pHGF治療組(C組)，36只。B、C組一次性給予25mg/kgPQ腹腔注射染毒，A組給予等量的生理鹽水腹腔內(nèi)注射，之后，C組立即給予pHGF1mg/kg腹腔注射，每12h一次，最長(zhǎng)用藥時(shí)間為14天，B組給予與C組等量生理鹽水腹腔注射。A、B、C組分別于染毒后1d、3d、5d、7d、10d、14d各取6只大鼠，乙醚麻醉后腹主動(dòng)脈取血處死，血液離心后取血清備測(cè)定血清BUN、Cr含量；而后迅速留取左腎上極組織，制成10％腎組織勻漿測(cè)

5、定MDA含量、SOD及GSH-Px活力，其余腎組織用10％甲醛固定，HE染色觀察病理學(xué)改變及免疫組織化學(xué)法觀察HGF及TGF-β1在中毒大鼠腎組織中的表達(dá)。 結(jié)果：1.大鼠中毒表現(xiàn)：大鼠于染毒后30min～2h即可出現(xiàn)中毒表現(xiàn)，B組主要表現(xiàn)為：倦怠、嗜睡、煩躁、進(jìn)食水明顯減少；呼吸急促、張口呼吸、口周紫紺；血尿、少尿或無(wú)尿；走路不穩(wěn)、肢體無(wú)力、頭顫；松毛、眼鼻血性分泌物等；C組經(jīng)pHGF治療后中毒表現(xiàn)較B組減輕，呼吸困難明顯改善

6、，血尿情況改善，少尿、無(wú)尿時(shí)間均明顯縮短。 2.PQ中毒大鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化(1)大體標(biāo)本A組：正常大鼠腎臟外觀不腫，色澤正常； B組：染毒大鼠腎臟外觀腫脹，被膜緊張，顏色深呈紫黑色，表面有散在出血點(diǎn)； C組：pHGF干預(yù)后大鼠腎臟外觀腫脹減輕，色澤紅，表面無(wú)明顯出血點(diǎn)。 (2)HE染色A組(Fig.4)：腎臟各部分結(jié)構(gòu)在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯病理變化； B組(Fig.5-9)：①腎小球：改變相對(duì)輕微，

7、僅為腎小球充血腫脹，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；②腎小管：1d時(shí)腎小管部分上皮細(xì)胞水腫、空泡變性，3d時(shí)腎小管上皮細(xì)胞均見(jiàn)水腫、滲出、壞死，管腔內(nèi)可見(jiàn)紅色顆粒狀壞死物，腎小管上皮間斷性損傷部位可見(jiàn)再生上皮細(xì)胞；5d時(shí)腎小管上皮細(xì)胞仍有水腫、壞死，管腔內(nèi)壞死物減少；7～10d時(shí)腎小管上皮細(xì)胞水腫減輕，管腔中壞死物逐漸減少，部分腎小管損傷已修復(fù)；14d時(shí)腎小管上皮細(xì)胞水腫消退，腔內(nèi)壞死物逐漸溶解消失，腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常；③腎間質(zhì)：水腫、充血伴大量

8、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)； C組(Fig.10-12)：pHGF干預(yù)后明顯減輕了腎臟病理改變，加速了損傷后的修復(fù)。①腎小球：充血腫脹明顯減輕；②腎小管：1d時(shí)可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞水腫減輕，無(wú)明顯壞死；3d時(shí)僅有小部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死，管腔內(nèi)可見(jiàn)少量壞死物，腎小管損傷部位可見(jiàn)較多再生上皮細(xì)胞；5d時(shí)腎小管上皮細(xì)胞輕度水腫，部分損傷腎小管己修復(fù)；7～10d時(shí)腎小管上皮細(xì)胞水腫消退，管腔中壞死物消失，損傷已基本修復(fù)；14d時(shí)腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)

9、正常。③腎間質(zhì)：可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。 3.血清BUN、Cr測(cè)定(table 1)A組：血清BUN、Cr各時(shí)段均在正常范圍內(nèi)； B組：BUN于第1d顯著升高，第3d達(dá)高峰，1d、3d、5d各時(shí)間點(diǎn)與A組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；5d后存活大鼠可逐漸下降，7～14d時(shí)段逐漸恢復(fù)正常，與A組比較無(wú)意義(P＞0.05)；A、B兩組比較Cr變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)： C組：BUN在1d、3d時(shí)較B組降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

10、義(P＜0.05)，5d、7d時(shí)段仍較B組降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；1d、3d時(shí)與A組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，以后各時(shí)間點(diǎn)與A組比較無(wú)意義(P＞0.05)；三組比較Cr變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 4.腎組織勻漿MDA、SOD及GSH-Px變化(table 2) 4.1 MDA測(cè)定(Fig.1，table 2)B組：染毒后1d、3d和5d各時(shí)間點(diǎn)MDA含量明顯高于A組(P＜0.01)，7d、

11、10d時(shí)段逐漸下降，但仍高于A組(P＜0.05)，14d時(shí)與A組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)； C組：染毒后1d、3d及5d各時(shí)間點(diǎn)MDA均較B組明顯降低(P＜0.05)，7～14d各時(shí)間點(diǎn)與B組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；1d和3d時(shí)段高于A組(P＜0.05)，其它各時(shí)間點(diǎn)與A組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 4.2 SOD測(cè)定(Fig.2，table 2)B組：染毒后1d、3d時(shí)段SOD活力均明顯低于

12、A組(P＜0.01)，5d和7d時(shí)段仍低于A組(P＜0.05)，10d、14d及SOD活力逐漸升高，與A組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); C組：染毒后1d、3d、5d及7d各時(shí)間點(diǎn)SOD活力均較B組升高(P＜0.05)；但1d與3d時(shí)明顯低于A組(P＜0.01)，其它各時(shí)間點(diǎn)與A組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 4.3 GSH-Px活性檢N(Fig.3，table 2)B組：染毒后1 d和3d時(shí)GSH-Px活力

13、低于A組(P＜0.05)，5d及以后各時(shí)間點(diǎn)活力逐漸升高，與A組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)； C組：染毒后1d和3d時(shí)段GSH-Px活力較B組增高(P＜0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)與B組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；各時(shí)間點(diǎn)與A組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 5治療前后腎組織HGF及TGF-β1的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果(Table 3) 5.1HGF在大鼠腎組織中的表達(dá)與分布(Fig.13-25)A組(

14、Fig.13)：HGF僅在腎小管少許表達(dá)； B組(Fig.14-19)：于染毒后1d，即可發(fā)現(xiàn)HGF在腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)，3d達(dá)高峰，與A組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，此后開(kāi)始緩慢下降，5～7d仍強(qiáng)于A組，與A組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；10～14d以后與A組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)； C組(Fig.20-25)：HGF仍主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中，且表達(dá)自1～7d各時(shí)間點(diǎn)均較B組

15、明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，10～14d與B組比較仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；在1～7d各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于A組(P＜0.01)；10～14d對(duì)與A組比較仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 5.2TGF-β1在大鼠腎組織中的表達(dá)與分布(Fig.26-38)A組(Fig.26)：可見(jiàn)TGF-β1在腎小管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中微弱表達(dá)； B組(Fig.27-32)：染毒后1d，TGF-β1表達(dá)明顯增強(qiáng)，7d達(dá)高峰，1～10d各時(shí)間點(diǎn)

16、與A組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；14d仍有表達(dá)，與A組相比仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；C組(Fig.33-38)：染毒后1d，TGF-β1在腎小管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中亦出現(xiàn)表達(dá)，1～14d各時(shí)間點(diǎn)與B組相比均減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；但與A組相比，1～7d各時(shí)間點(diǎn)TGF-β1的表達(dá)明顯高于A組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，10～14d與A組比較仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論1.百

17、草枯腹腔注射染毒可引起腎損傷，且主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞損傷，表明百草枯腹腔注射染毒是制造急性腎損傷動(dòng)物模型的可靠辦法； 2.百草枯中毒大鼠血清BUN于1d開(kāi)始升高，3d可達(dá)高峰，7～14d可恢復(fù)正常，證實(shí)百草枯致腎損傷時(shí)可出現(xiàn)BUN改變；Cr變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 3.百草枯中毒大鼠體內(nèi)MDA水平升高、SOD及GSH-Px活力下降，提示體內(nèi)存在過(guò)氧化損傷及氧化。抗氧化失衡，可能是百草枯致腎損傷的機(jī)制之一； 4.百草