創(chuàng)傷弧菌溶細胞素抗原表位預測、鑒定及免疫機制的探索.pdf

1、目的： 用生物信息軟件預測出創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(vibriovulnificuscytolysin)的抗原表位，利用噬菌體展示技術構(gòu)建噬菌體表位肽，篩選出有效抗原表位；并對創(chuàng)傷弧菌溶細胞素表位肽的免疫應答機制進行探索，為下一步研制創(chuàng)傷弧菌多抗原肽疫苗(MAP)奠定基礎。 方法： 1、溶細胞素T細胞和B細胞表位的預測采用PropredHLA-DRbindingpeptideprediction-ProPred的預測服

2、務器(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)以及EMBOSS軟件包中ANTIGENIC程序(http://bioinfo.hku.hk/EMBOSS/)、結(jié)合創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(Vvha)的二級結(jié)構(gòu)預測Vvha的T和B細胞表位，并根據(jù)Swiss-model提供的信息分析Vvha的B細胞表位的空間結(jié)構(gòu)從而選取聯(lián)合的T，B細胞表位進行研究。 2、重組噬菌體展示肽系統(tǒng)的構(gòu)建及鑒定PCR擴增法

3、獲取表位基因片段，分別用Acc65I，EagI酶酶切質(zhì)粒M13KE和表位基因片段，然后分別切膠回收酶切的目的片段，加入合適的T4連接酶，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli2738中。將被轉(zhuǎn)化E.coli.ER2738、IPTG/X-gal、溶化后冷卻至47℃左右頂層瓊脂混勻，傾注于含四環(huán)素(10mg/ml)的LB平板上，37℃培養(yǎng)6h后觀察結(jié)果。將噬菌斑小量培養(yǎng)后為模板，采用檢測引物(表1)進行PCR初步鑒定后測序。 3

4、、表位的初步篩選及鑒定采用10％分離膠的SDS-PAGE，含不同重組PⅢ蛋白(rPⅢ)噬菌體的上樣量均為1×1012，考馬斯亮藍染色后觀察各rPⅢ表達情況。重組蛋白rVvc兔抗血清為一抗，采用Westernblot對上述表位肽進行初步鑒定。實驗中以無任何插入片段的等量野生型噬菌體作為對照。 4、創(chuàng)傷弧菌溶細胞素表位肽免疫應答機制的探索小鼠腹腔免疫法測定各重組噬菌體的抗體效價；采用CCK-8試劑盒確定重組噬菌體的最佳刺激濃度后，采

5、用流式細胞術檢測各重組噬菌體免疫后的小鼠CD4+/CD8+T淋巴細胞比值、ELISA細胞因子檢測試劑盒檢測各重組噬菌體免疫后的小鼠IFN-r、IL-2、IL-4、IL-6細胞因予濃度。 結(jié)果： 1、Vvha表位預測結(jié)果及其選擇根據(jù)評分分數(shù)及T細胞和B細胞表位重疊情況，選擇Vvha1(194-217)、Vvha2(332-352)、Vvha3(295-314)、Vvha4(62-80)四個表位，Swiss-model顯示這

6、四個表位均位于Vvha分子表面。 2、噬菌體展示肽系統(tǒng)的構(gòu)建參照噬菌體展示系統(tǒng)試劑盒說明書和分子克隆書，用含四環(huán)素LB液體培養(yǎng)基小量培養(yǎng)有正確插入序列的目的重組噬菌體，PCR反應、SDS-page電泳結(jié)果顯示重組的噬菌體中確實插入了目的表位片段。 3、表位的初步篩選與鑒定SDS-page電泳及Westernblot結(jié)果顯示與野生型M13KE相比，重組的噬菌體中確實插入了目的表位片段，且M13KE-Vvha2、M13KE-

7、Vvha3、M13KE-Vvha4反應強度高于M13KE-Vvha1。 4、表位肽免疫應答機制的探索抗體效價結(jié)果顯示四個重組噬菌體表位肽的免疫原性均較高。流式細胞術及細胞因子測定表示重組噬菌體免疫后誘導機體T淋巴細胞向Th1、Th2型轉(zhuǎn)化，尤以Th1型轉(zhuǎn)化明顯，統(tǒng)計學分析，M13KE-Vvha2、M13KE-Vvha4免疫后機體在這兩項檢測中變化相對高。 結(jié)論： 本實驗成功預測創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(vibriovul