趨化因子受體CCR5、CCR6、CXCR3在不同人舌鱗癌細(xì)胞株的表達(dá)及其配體MIP-1β、MIP-3α、IP-10對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27增殖、凋亡及侵襲作用的影響.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、背景:
   口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是一種常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤,其中舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)發(fā)病率最高(約占OSCC的25%-40%),具有高侵襲性的生長(zhǎng)方式和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特征。盡管癌癥的治療已經(jīng)取得了重大進(jìn)展,但從20世紀(jì)60年代至今,OSCC的死亡率基本保持不變,5年生存率徘徊在50%左右,復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍

2、是影響預(yù)后的重要因素。然而腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,這不僅依賴于腫瘤細(xì)胞內(nèi)在的特征,還依賴于腫瘤所處微環(huán)境的一些因素。
   早在1979年,Lord就提出了腫瘤微環(huán)境的概念,即指腫瘤在其發(fā)生過(guò)程中的內(nèi)環(huán)境,由腫瘤細(xì)胞本身、間質(zhì)細(xì)胞、微血管、組織液及少量浸潤(rùn)細(xì)胞共同組成的一個(gè)復(fù)雜的集合系統(tǒng)。間質(zhì)細(xì)胞和癌細(xì)胞之間可以相互誘導(dǎo)、相互作用,以利于腫瘤的增殖和侵襲。
   然而,在腫瘤微環(huán)境中常常存在著慢性炎癥,這種炎癥多

3、數(shù)是由感染、低氧、低PH、高壓等特性引起。存在大量的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞趨化因子和多種蛋白水解酶,所產(chǎn)生的免疫炎性反應(yīng)有利于腫瘤的增殖、侵襲、粘附、血管生成以及對(duì)放、化療的抵抗,促使惡性腫瘤產(chǎn)生和發(fā)展。
   不難發(fā)現(xiàn),在對(duì)腫瘤微環(huán)境研究的很多方面都滲透著腫瘤與炎癥的聯(lián)系,腫瘤與炎癥的關(guān)系已經(jīng)成為腫瘤研究的新方向,腫瘤炎癥微環(huán)境的研究已經(jīng)成為當(dāng)今腫瘤研究的熱點(diǎn)。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中利用高通量、精確的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)(抗炎癥因子芯片)對(duì)3種不

4、同侵襲能力的人舌鱗癌細(xì)胞(UM-1、CAL-27、Tca-8113)和人正??谇火つど掀ぜ?xì)胞培養(yǎng)上清中的炎癥因子進(jìn)行了初步篩選后發(fā)現(xiàn),與侵襲性相對(duì)較低腫瘤細(xì)胞(Tca-8113)和正常口腔黏膜細(xì)胞相比,巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1β(MIP-1β)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-3α(MIP-3α)、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(IP-10)在侵襲性相對(duì)較高的腫瘤細(xì)胞株(UM-1、CAL-27)中高表達(dá)。然而,在人舌鱗癌腫瘤細(xì)胞中MIP-1β、MIP-3α、IP-

5、10相關(guān)受體CCR5、CCR6、CXCR3的表達(dá)國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道,MIP-1β/CCR5、MIP-3α/CCR6、IP-10/CXCR3軸在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的具體機(jī)制還不清楚。
   MIP-1β、MIP-3α、IP-10都是趨化因子超家族成員,能夠趨化細(xì)胞的定向運(yùn)動(dòng)?,F(xiàn)在越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞可以自分泌某些趨化因子,通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,瘤內(nèi)新生血管的生成,細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶的分泌,或者抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫,促進(jìn)

6、腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。趨化因子和其相應(yīng)的受體相互作用,在抗腫瘤的免疫、腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著廣泛的生理和病理作用。而在舌鱗癌中關(guān)于MIP-1β/CCR5、MIP-3α/CCR6、IP-10/CXCR3的相關(guān)研究較少,其各自在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的具體機(jī)制還不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western Blot和免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)CCR5、CCR6、CXCR3在3種人舌鱗癌細(xì)胞株的表達(dá)情況;通過(guò)CCK-8法分別檢測(cè)MIP-1β、MIP-3α

7、、IP-10對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27增殖的影響;通過(guò)Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)其對(duì)CAL-27細(xì)胞凋亡的影響;通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)CAL-27細(xì)胞侵襲性的影響,初步探討MIP-1β、MIP-3α、IP-10在舌鱗癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。
   研究?jī)?nèi)容共分三章:第一章CCR5、CCR6、CXCR3在3種人舌鱗癌細(xì)胞株的表達(dá);第二章MIP-1β、MIP-3α、IP-10對(duì)人舌鱗

8、癌細(xì)胞CAL-27增殖、凋亡影響的研究;第三章MIP-1β、MIP-3α、IP-10對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27侵襲性影響的研究。
   第一章、CCR5、CCR6、CXCR3在3種人舌鱗癌細(xì)胞株的表達(dá)
   目的:
   檢測(cè)在3種人舌鱗癌細(xì)胞株UM-1、CAL-27、Tca-8113中CCR5、CCR6、CXCR3蛋白的表達(dá)及定位。為體外探討MIP-1β、MIP-3α、IP-10對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的研究奠定基

9、礎(chǔ)。
   方法:
   取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),分別采用Western blot和免疫熒光染色對(duì)3種人舌鱗癌細(xì)胞株UM-1、CAL-27、Tca-8113中CCR5、CCR6、CXCR3的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
   結(jié)果:
   Western blot結(jié)果顯示CCR5、CCR6、CXCR3在3種人舌鱗癌細(xì)胞株均有表達(dá),分別在40.524 k D、42.494 k D、40.660 k D處均可見(jiàn)蛋白

10、表達(dá)條帶。免疫熒光染色結(jié)果顯示CCR5、CCR6、CXCR3在3種人舌鱗癌細(xì)胞株的細(xì)胞膜及胞質(zhì)內(nèi)均有表達(dá)。
   第二章、MIP-1β、MIP-3α、IP-10對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27增殖、凋亡影響的研究
   目的:
   觀察MIP-1β、MIP-3α、IP-10對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27增殖、凋亡的影響。
   方法:
   1.取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的細(xì)胞,經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)同步化處理24h后用于實(shí)

11、驗(yàn)。根據(jù)MIP-1β(MIP-3α、IP-10)刺激濃度的不同,實(shí)驗(yàn)分別分為四組:對(duì)照組(0ng/mL組)、10ng/mL組、20ng/mL組、40ng/mL組。用CCK-8法分別檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在12h、24h、48h時(shí),對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖的影響。
   2.實(shí)驗(yàn)分組同前,根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別加入0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL MIP-1β(MIP-3α、IP-10)處理24h,Annexin

12、 V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)CAL-27細(xì)胞的凋亡情況。
   結(jié)果:
   (1)和對(duì)照組相比,12h、24h時(shí),10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的MIP-1β對(duì)CAL-27細(xì)胞均有促進(jìn)增殖的作用(P值均小于0.05);48h時(shí),10ng/mL、20ng/mL的MIP-1β對(duì)CAL-27細(xì)胞有促進(jìn)增殖的作用(P值均小于0.05),但40ng/mL MIP-1β對(duì)CAL-27細(xì)胞的增殖無(wú)影響(P>0.05)

13、;24h時(shí),40ng/mLMIP-1β組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.05);而10ng/mL、20ng/mLMIP-1β組細(xì)胞凋亡率和對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P值均大于0.05)。
   (2)和對(duì)照組相比,12h、24h、48h時(shí),10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的MIP-3α對(duì)CAL-27細(xì)胞均有促進(jìn)增殖的作用(P值均小于0.05),但各濃度之間沒(méi)有顯著性差異(P值均大于0.05);24h時(shí),各實(shí)驗(yàn)組CA

14、L-27細(xì)胞凋亡率和對(duì)照組之間均無(wú)顯著性差異(P值均大于0.05)。
   (3)和對(duì)照組相比,12h時(shí),10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的IP-10均能夠促進(jìn)CAL-27細(xì)胞增殖(P<0.05),并且存在濃度依賴性;24h時(shí),不同濃度的IP-10亦能夠促進(jìn)CAL-27增殖(P<0.05),但濃度依賴性消失;在48 h時(shí),只有40ng/mL的IP-10能夠促進(jìn)CAL-27增殖(P<0.05),10ng/mL、20n

15、g/mL的IP-10對(duì)CAL-27細(xì)胞的增殖無(wú)促進(jìn)作用(P>0.05);當(dāng)IP-10的刺激濃度為10ng/mL和20ng/mL時(shí),隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),其增殖率下降,在48 h時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖已無(wú)促進(jìn)作用。24h時(shí),各實(shí)驗(yàn)組CAL-27細(xì)胞的凋亡率均明顯高于對(duì)照組(P值均小于0.05),但各濃度之間未見(jiàn)顯著差異(P值均大于0.05)。
   第三章、MIP-1β、MIP-3α、IP-10對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27侵襲性影響的研究

16、>   目的:
   觀察MIP-1β、MIP-3α、IP-10對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27侵襲性的影響。
   方法:
   1.本實(shí)驗(yàn)采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分別觀察對(duì)照組0ng/mL PBS和實(shí)驗(yàn)組80ng/m LMIP-1β(MIP-3α、IP-10)對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27侵襲性的影響;
   2.采用明膠酶譜實(shí)驗(yàn)分別驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)組80ng/mL MIP-3α、IP-10對(duì)CAL-27細(xì)胞的

17、促侵襲效應(yīng),并檢測(cè)處理24h后各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP-2、MMP-9的酶活性情況。以相同體積的PBS溶液設(shè)為陰性對(duì)照。
   結(jié)果:
   Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:80ng/mL MIP-3α、IP-10組CAL-27細(xì)胞的侵襲率顯著高于對(duì)照組(P均小于0.05),而80ng/mL MIP-1β組CAL-27細(xì)胞的侵襲率和對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05);明膠酶譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:80ng/mLMIP-3α、

18、IP-10組細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP-2、MMP-9的活性均顯著高于對(duì)照組(P均小于0.05)。
   全文結(jié)論:
   1.CCR5、CCR6、CXCR3在3種人舌鱗癌細(xì)胞株的細(xì)胞膜及胞質(zhì)中均有表達(dá);
   2.MIP-1β對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27有促進(jìn)增殖的作用,但相對(duì)較高濃度的MIP-1β對(duì)CAL-27的凋亡也有促進(jìn)作用。隨著較高濃度MIP-1β作用時(shí)間的延長(zhǎng),促增殖作用在減弱,而這種減弱可能是由較高濃度MI

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