關(guān)于CD147通過IGFBP2調(diào)控惡性黑色素瘤凋亡的體內(nèi)外相關(guān)研究.pdf

1、目的:
　　惡性黑素瘤(malignant melanoma，MM)是來源于黑色素細胞的一種侵襲力強、轉(zhuǎn)移性高、進展迅速、預(yù)后極差的高度惡性腫瘤，其發(fā)病率隨著近年來環(huán)境惡化呈上升趨勢。目前臨床上放化療的主要目的是誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，凋亡的機制研究也就成為了腫瘤細胞生物學的研究熱點。CD147分子是一種在多種腫瘤中高表達的跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族。本研究組前期研究證實CD147在皮膚MM細胞中表達上調(diào)，并參與了腫瘤組織侵襲、遠

2、處轉(zhuǎn)移和腫瘤血管新生。近年來的研究表明CD147參與了MM細胞的凋亡，而其機制尚不清楚。我們通過蛋白芯片技術(shù)，探討CD147參與MM凋亡的作用及內(nèi)在機制，初步探討了CD147作為臨床腫瘤治療靶點的可能性。
　　本研究中，我們首先建立了CD147敲降的皮膚MM(A375-sh-CD147)細胞株，明確了CD147干擾對A375細胞凋亡的影響;通過人凋亡抗體芯片，找出了與CD147相互作用的凋亡相關(guān)蛋白譜，在這一系列蛋白中IGFBP2

3、(Insulin-like Growth Factor BindingProtein2)受CD147調(diào)控最顯著;我們隨后證實了CD147可以通過Akt/mTOR途徑調(diào)控IGFBP2的表達，進而介導(dǎo)MM細胞的凋亡;同時通過裸鼠皮下成瘤模型進一步在體內(nèi)水平明確CD147-IGFBP2與凋亡的相互關(guān)系。最后，我們利用MM組織芯片，在大樣本量臨床組織中證實了CD147和IGFBP2表達的相關(guān)性。本研究旨在明確CD147分子在皮膚MM凋亡中的作用

4、及調(diào)控機制，為臨床MM抗凋亡治療提供創(chuàng)新的靶分子。
　　方法:
　　1.運用shRNA干擾技術(shù)抑制CD147的表達，Western Blot鑒定轉(zhuǎn)染有效性，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株(A375-sh-CD147-C1/C2)。
　　2.運用凋亡的相關(guān)檢測方法，包括Western Blot檢測cle-PARP和PTEN、電鏡檢測A375-sh-ctrl和A375-sh-CD147兩組細胞凋亡的形態(tài)學改變、Annexin V FI

5、TC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測兩組細胞組的凋亡情況。
　　3.應(yīng)用人細胞凋亡的抗體芯片對A375-sh-ctrl和A375-sh-CD147兩組細胞的總蛋白進行檢測，運用LuxScan10K-A掃描、并采用Cluster軟件比較分析找出受CD147調(diào)控的凋亡相關(guān)蛋白譜。
　　4.CD147和IGFBP2相互關(guān)系的研究:Western Blot和RealTime-PCR技術(shù)驗證差異蛋白質(zhì)IGFBP2在各組細胞的表達情況;免疫共沉

6、淀法檢測CD147和IGFBP2二者是否直接相互作用;WesternBlot檢測信號通路蛋白Akt/mTOR在A375-sh-ctrl和A375-sh-CD147細胞組中的表達;在A375-sh-ctrl細胞中加入Akt信號通路抑制劑后，檢測IGFBP2的表達是否有變化。
　　5.構(gòu)建裸鼠MM皮下異種移植模型，分為A375-sh-ctrl組和A375-sh-CD147組;運用免疫組化檢測CD147和IGFBP2的表達;并運用TUN

7、EL技術(shù)檢測兩組的凋亡情況;免疫組化檢測cle-PARP的表達。
　　6.運用皮膚MM組織芯片研究CD147和IGFBP2的表達。
　　結(jié)果:
　　1.成功建立CD147shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆(A375-sh-CD147-C1，A375-sh-CD147-C2)，Western Blot表明其抑制率分別為86.21％±8.30％，和28.9％±5.72％（P均＜0.01），選擇抑制效果較好的細胞克隆A375-sh

8、-CD147-C1（簡寫為A375-sh-CD147）用于開展后續(xù)的研究工作。
　　2.用5氟尿嘧啶(150μg/mL)處理細胞，誘導(dǎo)凋亡
　　2.1)相對A375-sh-ctrl細胞，在A375-sh-CD147細胞中， cle-PARP的表達明顯增高3.12±0.22倍(P＜0.01)，PTEN的表達也顯著增高3.42±0.28倍(P＜0.01);
　　2.2)相對A375-sh-ctrl細胞，A375-sh-CD

9、147細胞形態(tài)出現(xiàn)環(huán)狀、凝塊狀的核染色質(zhì)或星月狀小體（凋亡小體）等一系列凋亡細胞特征;
　　2.3)相對A375-sh-ctrl細胞，A375-sh-CD147細胞的凋亡率明顯增高4.38±0.25倍(P＜0.01)。
　　3.人細胞凋亡抗體芯片檢測A375-sh-ctrl和A375-sh-CD147細胞組，發(fā)現(xiàn)包括IGFBP2等9個凋亡相關(guān)蛋白的表達有明顯差異(P均＜0.01)。
　　4.CD147可以調(diào)控IGFBP

10、2:
　　4.1)IGFBP2蛋白在A375-sh-CD147細胞中的表達，相對A375-sh-ctrl細胞明顯降低2.91±0.23倍(P＜0.01)，同時IGFBP2 mRNA的表達也顯著降低3.42±0.28倍(P＜0.01)。
　　4.2)CD147和IGFBP2沒有直接發(fā)生相互作用;
　　4.3) p-Akt在A375-shRNA-CD147細胞中的表達降低了3.84±0.22倍，p-mTOR的表達也顯著降低

11、2.42±0.20倍（P均＜0.01），證明CD147可能通過Akt/mTOR信號通路調(diào)控IGFBP2的表達;
　　4.4)加入Akt信號通路抑制劑后，IGFBP2的表達明顯降低3.69±0.74倍(P＜0.01)，證實了Akt信號通路可以上游調(diào)控IGFBP2蛋白的產(chǎn)生。
　　5.5.1)成功構(gòu)建了裸鼠MM皮下異種移植模型;
　　5.2)相對于A375-sh-ctrl組的瘤體，CD147和IGFBP2的表達在A375-

12、sh-CD147組的瘤體中都顯著降低(P＜0.01);
　　5.3) A375-sh-CD147組的瘤體凋亡顯著增加(P＜0.01);
　　5.4)cle-PARP在A375-sh-CD147組的瘤體中的表達也明顯增加(P＜0.01)。
　　6.運用皮膚MM組織芯片檢測了192例臨床組織中CD147和IGFBP2的表達情況，發(fā)現(xiàn)二者的表達正相關(guān)，并且二者在轉(zhuǎn)移性MM中的表達都顯著高于原位MM(P＜0.05)。