CD147在H-,2-O-,2-所致惡性黑色素瘤細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的： (1)建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CD147siRNA的惡性黑色素瘤(MalignantMelanoma，MM)A375細(xì)胞株； (2)了解在H2O2所致的氧化應(yīng)激下，CD147siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)A375細(xì)胞存活率和凋亡狀態(tài)的影響； (3)初步明確CD147分子保護(hù)A375細(xì)胞、減輕氧化損傷的機(jī)制。 方法： (1)將前期構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSUPER/CD147siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至A375細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)染空白質(zhì)

2、粒作為對(duì)照，采用半定量RT-PCR法和Westem blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CD147mRNA和蛋白的表達(dá)變化； (2)采用MTT法檢測(cè)不同濃度H2O2對(duì)A375細(xì)胞的存活抑制率，并選擇適宜的作用濃度； (3)采用MTT法檢測(cè)CD147siRNA對(duì)A375細(xì)胞受氧化應(yīng)激后細(xì)胞存活抑制率的影響； (4)采用光鏡觀察CD147siRNA對(duì)A375細(xì)胞受氧化應(yīng)激后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響； (5)采用試劑盒(JC-

3、1染色法)檢測(cè)CD147siRNA對(duì)A375細(xì)胞受氧化應(yīng)激后細(xì)胞線粒體膜電位改變的影響； (6)采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)CD147siRNA對(duì)A375細(xì)胞受氧化應(yīng)激后細(xì)胞凋亡指數(shù)(Apoptotie Index，AI)變化的影響； (7)采用試劑盒檢測(cè)CD147siRNA對(duì)A375細(xì)胞受氧化應(yīng)激后活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SO

4、D)和丙二醛(malonyldialdehyde，MDA)水平變化的影響。 結(jié)果： (1)轉(zhuǎn)染pSUPER/CD147siRNA后，A375細(xì)胞中CD147mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著降低，二條針對(duì)CD147不同位點(diǎn)的siRNA的干擾效果分別為mRNA水平：77.96％(P<0.05)和73.39％(P<0.05)，蛋白水平：71.83％(P<0.05)和69.93％(P<0.05)，并將其建立為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的惡性黑色素瘤細(xì)

5、胞株，分別命名為C1和C2，用于開展下一步的研究，轉(zhuǎn)染pSUPER空白質(zhì)粒的A375細(xì)胞中CD147mRNA和蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)，命名為A375-vector； (2)不同濃度H2O2處理A375細(xì)胞12h后，細(xì)胞存活抑制率呈濃度依賴性上升，計(jì)算得出IC50為463.1μM，選擇300μM作為適宜濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)； (3)300μM H2O2作用各組細(xì)胞12h后，C1和C2細(xì)胞存活抑制率明顯高于A3

6、75和A375-vector細(xì)胞，差異具有顯著性(P<0.05)，A375和A375-vector細(xì)胞間比較無(wú)明顯差異(P>0.05)； (4)300μM H2O2作用各組細(xì)胞24h后，細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生了改變，C1和C2細(xì)胞形態(tài)變化較A375和A375-vector細(xì)胞更為明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞稀疏和明顯的胞漿皺縮； (5)300μM H2O2作用各組細(xì)胞12h后，細(xì)胞凋亡率均較處理前上升，但C1和C2細(xì)胞凋亡率升高較A375和

7、A375-vector細(xì)胞更為明顯，差異具有顯著性(P<0.05)，A375和A375-vector細(xì)胞間比較無(wú)明顯差異(P>0.05)； (6)300μM H2O2作用各組細(xì)胞3h后，細(xì)胞線粒體膜電位均有降低，但C1和C2細(xì)胞線粒體膜電位降低較A375和A375-vector細(xì)胞更為明顯，而A375和A375-vector細(xì)胞間比較無(wú)明顯差異； (7)300μM H2O2作用各組細(xì)胞3h后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平均有增高，但

8、C1和C2細(xì)胞中ROS水平升高明顯高于A375和A375-vector細(xì)胞，差異具有顯著性(P<0.05)，A375和A375-vector細(xì)胞間比較無(wú)明顯差異(P>0.05)； (8)300μM H2O2作用各組細(xì)胞12h后，所有細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)T-SOD和Mn-SOD活性均降低，MDA水平均升高，但C1和C2細(xì)胞中T-SOD和Mn-SOD活性降低較A375和A375-vector細(xì)胞更為明顯(P<0.05)，MDA水平升高亦較A3

9、75和A375-vector細(xì)胞更為明顯(P<0.05)，A375和A375-vector細(xì)胞間比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。 結(jié)論： (1)建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSUPER/CD147siRNA的A375惡性黑色素瘤細(xì)胞株； (2)在H2O2所致的氧化應(yīng)激下，CD147siRNA可以進(jìn)一步促進(jìn)A375細(xì)胞存活率的下降、凋亡程度的上升； (3)在H2O2所致的氧化應(yīng)激下，CD147siRNA可能通過(guò)加重細(xì)胞抗