甲基化寡核苷酸誘導滅活EDNRB基因在先天性巨結腸發(fā)病機制中的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 甲基化寡核苷酸誘導滅活小鼠胚胎干細胞 EDNRB基因
　　目的:先天性巨結腸(Hirschsprung’s disease,HD)是新生兒最常見的腸道畸形之一,發(fā)病因素包括遺傳因素和環(huán)境因素。EDNRB/EDN3/ECE1信號傳導通路的異常是 HD重要發(fā)病機制,但該信號傳導通路相關基因突變不能解釋全部 HD患者病因,HD中EDNRB基因突變率僅3％左右。本研究旨在設計合成特異性

2、甲基化寡核苷酸誘導滅活EDNRB基因,探討 EDNRB基因甲基化與 HD發(fā)病機制的關系。
　　方法:在 Genbank和DBTSS數據庫檢索小鼠EDNRB基因序列及啟動子序列,根據甲基化寡核苷酸設計原理設計與 EDNRB基因啟動子互補甲基化寡核苷酸,在5’端標記 FITC,采用Effectine將寡核苷酸轉染至 C57BL/6小鼠胚胎干細胞,采用流式細胞分選儀分選 FITC陽性細胞,并將1μM5-Aza-dC處理轉染后 C57BL

3、/6小鼠胚胎干細胞,采用重亞硫酸鹽測序法(BSP)、實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)和Western blot檢測轉染前后及5-Aza-dC處理后 C57BL/6小鼠胚胎干細胞 EDNRB基因啟動子甲基化狀態(tài)及mRNA和蛋白質表達改變。
　　結果:C57BL/6小鼠EDNRB基因啟動子1008～2889bp為 CpG島:A％:23.22,T％:23.65,C％:25.13,G％:28.00,C+G％:53.13,CpG％:4

4、.20,A+T/C+G％:0.88。采用Effectine轉染寡核苷酸至 C57BL/6小鼠胚胎干細胞效率為40.2％。MON1與 BSP擴增產物第3、4、5CG位點對應;MON1轉染前,C57BL/6小鼠胚胎干細胞 EDNRB基因啟動子1～16CG位點甲基化率均為0.0％;轉染 MON1后 BSP測序示1～2CG位點和6～16CG位點甲基化率分別為30％、40％、50％、40％、40％、40％、40％、40％、40％、30％、20％、

5、20％和10％,MON1對應的BSP擴增產物3、4、5CG位點甲基化率分別為60％、60％和60％;5-Aza-dC處理后,C57BL/6小鼠胚胎干細胞 EDNRB基因啟動子1～16CG位點甲基化率均為0.0％。MON2對應 BSP擴增產物9、10、11CG位點;MON2轉染前,EDNRB基因1～16CG位點甲基化率均為0.0％;轉染后1～8CG位點和12～16CG位點甲基化率分別為20％、30％、40％、40％、50％、40％、50％

6、、60％、70％、60％、40％、40％和30％,MON2對應9、10、11CG位點甲基化率為70％;5-Aza-dC處理后,C57BL/6小鼠胚胎干細胞 EDNRB基因啟動子1～16CG位點甲基化率均為0.0％。MON3對應 BSP擴增產物13、14、15CG位點,轉染前,互補 EDNRB基因啟動子1～20CG位點甲基化率均為0.0％;轉染后1～12CG位點、16～20CG甲基化率分別為10％、10％、30％、30％、30％、40％、

7、50％、50％、50％、60％、60％、60％、60％、60％、50％、30％和10％,MON3對應13、14、15CG位點甲基化率為70％;5-Aza-dC處理后,C57BL/6小鼠胚胎干細胞 EDNRB基因啟動子1～20CG位點甲基化率均為0.0％。MON4對應 BSP擴增產物第2、3、4、5CG位點;轉染前對應 EDNRB基因1～8CG位點甲基化率均為0.0％;轉染后,第1CG位點、MON4對應2、3、4、5CG位點和6～8CG和

8、甲基化率為分別為10％、20％、20％、20％、20％、10％、10％和0％;5-Aza-dC處理后,EDNRB基因啟動子1～8CG位點甲基化率均為0.0％。CON1與 MON2除 mCG外堿基序列一致,CON1轉染前、轉染后及5-Aza-dC處理后 C57BL/6小鼠胚胎干細胞 EDNRB基因啟動子1～16CG位點甲基化率均為0.0％。CON2與 MON2除首尾外堿基序列一致,CON2轉染前、轉染后及5-Aza-dC處理后 EDNRB

9、基因啟動子1～16CG位點甲基化率均為0.0％。轉染前 MON1、MON2、MON3、MON4、CON1和CON2 C57BL/6 mESC細胞 EDNRB/GAPDH無明顯差異(均P>0.05);轉染后,MON1、MON2、MON3轉染的C57BL/6 mESC細胞 EDNRB/GAPDH較轉染前顯著降低(均 P<0.05);轉染 MON4、CON1和CON2的C57BL/6 mESC細胞EDNRB/GAPDH較轉染前無明顯差異(均

10、P>0.05);5-Aza-dC處理后,轉染 MON1、MON2、MON3的細胞 EDNRB/GAPDH較作用前顯著升高(均 P<0.05),處理后 MON4、CON1和CON2細胞的EDNRB/GAPDH無明顯差異(均 P>0.05)。MON4、CON1和CON2轉染后 EDNRB蛋白質表達水平與正常未轉染細胞無明顯差異(P>0.05),甲基化寡核苷酸 MON1、MON2和MON3轉染后 C57BL6/J mESC細胞 EDNRB蛋白

11、質表達水平顯著低于正常未轉染細胞和寡核苷酸 MON4、CON1及CON2轉染細胞(均P<0.05);轉染 MON3甲基化寡核苷酸后 C57BL6/J mESC細胞 EDNRB蛋白質表達水平顯著低轉染甲基化寡核苷酸 MON1和MON2的C57BL6/J mESC細胞(均 P<0.05);轉染甲基化寡核苷酸 MON2后 EDNRB蛋白質表達水平低于轉染甲基化寡核苷酸MON1細胞,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。5-Aza-dC作用后,轉

12、染 MON1、MON2、MON3、MON4、CON1和CON2的C57BL6/J mESC細胞與未轉染細胞 EDNRB蛋白質表達無明顯差異。
　　結論:特異互補甲基化寡核苷酸可誘導 EDNRB基因啟動子產生甲基化,其誘導產生甲基化及抑制基因表達能力與甲基化寡核苷酸靶向 EDNRB基因啟動子位置有關。
　　第二部分 甲基化寡核苷酸誘導 EDNRB基因啟動子甲基化的遺傳
　　目的:甲基化作為表觀遺傳學最重要的調控機制,具有

13、遺傳穩(wěn)定性特點,可在代代間、細胞周期中穩(wěn)定遺傳。在細胞有絲分裂 DNA半保留復制時,甲基化雙鏈解鏈形成復制叉樣模板,作為半甲基化底物在 DNMT1催化下 CG變成 mCG,這種半保留復制機制使甲基化在細胞分裂中得到有效遺傳。本研究設計特異性針對 EDNRB基因啟動子甲基化寡核苷酸誘導其產生甲基化,檢測不同培養(yǎng)代數時 EDNRB基因啟動子甲基化狀態(tài),探討甲基化寡核苷酸誘導 EDNRB基因啟動子產生的甲基化的遺傳性。
　　方法:在 G

14、enbank和DBTSS數據庫檢索小鼠EDNRB基因序列及啟動子序列,根據甲基化寡核苷酸設計原理設計與 EDNRB基因啟動子互補甲基化寡核苷酸,在5’端標記 FITC,采用Effectine將寡核苷酸轉染至 C57BL/6小鼠胚胎干細胞,采用流式細胞分選儀分選 FITC陽性細胞并連續(xù)培養(yǎng),采用重亞硫酸鹽測序法(BSP)、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot檢測轉染前后及培養(yǎng)不同代數時C57BL/6小鼠胚胎干細胞

15、 EDNRB基因啟動子甲基化狀態(tài)及mRNA和蛋白質表達改變。
　　結果:MON1、MON2、MON3和MON4轉染后互補 EDNRB基因啟動子對應 CG位點甲基化率分別由0％、0％、0％和0％增加到60％、70％、70％和20％,轉染 CON1和CON2前及轉染后互補 EDNRB基因啟動子對應 CG甲基化率均為0％;MON1、MON2、MON3和MON4互補 EDNRB基因啟動子對應 CG位點甲基化率隨著培養(yǎng)代數增加而下降,MON

16、1、MON2和MON3轉染后培養(yǎng)6代時互補 EDNRB基因啟動子對應 CG位點甲基化率下降至0％;MON4轉染后培養(yǎng)3代互補 EDNRB基因啟動子對應CG位點甲基化率下降至0％。MON1、MON2和MON3轉染后EDNRB基因 mRNA和蛋白質顯著降低,MON4、CON1和CON2轉染后較轉染前無明顯改變;將轉染細胞培養(yǎng),MON1、MON2、MON3和MON4甲基化寡核苷酸轉染的EDNRB基因 mRNA和蛋白質表達隨培養(yǎng)代數的增加而增加

17、,MON1、MON2、MON3在轉染培養(yǎng)6代時EDNRB基因 mRNA和蛋白質表達增加至轉染前水平;MON4在轉染培養(yǎng)3代時EDNRB基因 mRNA和蛋白質表達增加至轉染前水平;CON1和CON2轉染前后EDNRB基因 mRNA表達無明顯改變。
　　結論:甲基化寡核苷酸誘導 EDNRB基因啟動子產生的甲基化不具有穩(wěn)定的遺傳性,隨著培養(yǎng)代數增加,EDNRB基因啟動子甲基化逐漸消失,抑制的mRNA和蛋白質表達逐漸恢復。通過甲基化寡核苷