“香胃聯(lián)合方組”防治肝硬化腸源性內(nèi)毒素血癥的實驗研究.pdf

1、目的：
　　本課題從濕濁角度分析肝硬化腸源性內(nèi)毒素血癥病機，探討香胃聯(lián)合方組對復合因素誘導肝硬化大鼠血漿內(nèi)毒素水平的影響，明確香胃聯(lián)合方組對內(nèi)毒素導致肝硬化大鼠肝臟保護作用，揭示香胃聯(lián)合方組防治肝硬化腸源性內(nèi)毒素血癥作用機理，為肝硬化腸源性內(nèi)毒素血癥的防治提供新的思路和方法。
　　方法：
　　將85只Wistar大鼠隨機分成正常組10只，香胃聯(lián)合預防組（簡稱預防組）10只，乳果糖預防組（簡稱預對組）10只及純造模組55

2、只。除正常組外，其余均使用四氯化碳復合因素制造肝硬化模型。按首次0.5ml/l00g、之后0.3ml/l00g劑量皮下注射40％四氯化碳橄欖油溶液，一周二次，同時輔以89.5%玉米面、10%豬油和0.5%膽固醇混和飼料喂養(yǎng)，以10%酒精為唯一飲料。造模期間，預防組給予香砂六君子湯6.875g·kg-1d-1、胃苓湯7.188 g·kg-1d-1隔日交替灌胃；預對組給予乳果糖口服溶液2.083g·kg-1d-1灌胃，日一次；正常組和純造模

3、組每日一次給予等量生理鹽水1ml/100g灌胃。造模持續(xù)8周。造模過程中，大鼠死亡19只，其中預防組死亡1只，預對組死亡2只，純造模組死亡12只，用于判定造模情況處死4只，其中正常組處死2只，純造模組處死2只。造模成功后，將純造模組再隨機分為5組：模型組9只，香胃聯(lián)合方組（簡稱香胃組）8只，香砂六君子湯組（簡稱香砂組）8只，胃苓湯組（簡稱胃苓組）8只，乳果糖對照組（簡稱治對組）8只。預防組、預對組繼續(xù)給予相應(yīng)的藥灌胃；正常組和模型組繼續(xù)

4、給予等量生理鹽水灌胃；香胃組給予香砂六君子湯6.875g·kg-1d-1、胃苓湯7.188 g·kg-1d-1隔日交替灌胃；香砂組給予香砂六君子湯6.875g·kg-1d-1灌胃，日一次；胃苓組給予胃苓湯7.188 g· kg-1d-1灌胃，日一次；治對組給予乳果糖口服溶液2.083g·kg-1d-1灌胃，日一次；用藥共持續(xù)4周。
　　實驗過程中觀察大鼠的一般狀況及體重變化情況，用藥治療結(jié)束后處死取材。肉眼觀察大鼠新鮮肝臟；計算大

5、鼠肝重指數(shù)和脾重指數(shù)；全自動生化分析儀檢測大鼠血清肝功AST（天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）、ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）、ALB（白蛋白）、GLB（球蛋白）、A/G（白蛋白/球蛋白）指標；鱟試劑顯色基質(zhì)法檢測大鼠血漿內(nèi)毒素水平； ELISA法檢測大鼠血清 NO(一氧化氮)、HA（透明質(zhì)酸）、LN（層粘連蛋白）、PCⅢ（Ⅲ型前膠原）、Ⅳ-C（Ⅳ型膠原）、TNF-α（腫瘤壞死因子-a）、IL-6（白細胞介素-6）、IFABP（腸脂肪酸結(jié)合蛋白）、D

6、-乳酸水平；ELISA法檢測大鼠肝組織Hyp（羥脯氨酸）及小腸組織S-IgA含量；取大鼠肝臟組織作病理切片，進行HE染色和Masson染色評定肝硬化損傷程度；取回腸組織作病理切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠腸黏膜損傷情況；免疫組化法測大鼠肝組織α-SMA（α-平滑肌肌動蛋白）、TLR4（Toll樣受體4）、NF-κB（核轉(zhuǎn)錄因子-κB）表達；Real-time PCR法檢測大鼠肝臟組織TLR4mRNA、MyD88mRNA、N

7、F-κB mRNA表達；Real-time PCR法檢測大鼠小腸組織Occludin mRNA表達。
　　結(jié)果：
　　1香胃聯(lián)合方組、香砂六君子湯、胃苓湯和乳果糖均能改善大鼠的一般狀況，增加體重，其中香胃組、香砂組、胃苓組之間在體重增加方面無明顯差異，而與治對組比較有明顯差異（P＜0.05）；預防組與香胃組比較有顯著差異（P＜0.01）。
　　2肝重指數(shù)和脾重指數(shù)：與模型組相比，正常組、預防組、預對組、香胃組、胃苓組、

8、香砂組及治對組差異顯著（P＜0.01）；預防組與預對組之間有明顯差異（P＜0.05）；與預防組相比，香胃組、胃苓組、香砂組及治對組有顯著性差異（P＜0.01）；香胃組、胃苓組和香砂組之間無明顯差異（P＞0.05）；香胃組與預對組之間有顯著性差異（P＜0.01）；與治對組相比，香胃組、胃苓組和香砂組差異明顯（P＜0.05）；與正常組相比，預防組、預對組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對組有顯著性差異（P＜0.01）。
　　3肝功、HA、

9、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、NO、TNF-α、IL-6水平及肝組織Hyp 含量：與模型組相比，正常組、預防組、預對組、香胃組、胃苓組、香砂組和治對組差異顯著（P＜0.01）；預防組與預對組之間有明顯差異（P＜0.05）；與預防組相比，香胃組、胃苓組、香砂組及治對組有顯著性差異（P＜0.01）；香胃組、胃苓組和香砂組之間無明顯差異（P＞0.05）；香胃組與預對組之間有明顯差異（P＜0.05或P＜0.01）；與治對組相比，香胃組、胃苓組

10、和香砂組差異明顯（P＜0.05）；與正常組相比，預防組、預對組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對組有顯著性差異（P＜0.01）；
　　4內(nèi)毒素、IFABP及D-乳酸水平：與模型組相比，正常組、預防組、預對組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對組差異性明顯（P＜0.01）；預防組與預對組之間有明顯差異（P＜0.05）；與預防組相比，香胃組、胃苓組、香砂組及治對組有顯著性差異（P＜0.01）；與香胃組相比，胃苓組和香砂組差異明顯（P＜0.05）

11、；與香胃組相比，預對組和治對組有顯著性差異（P＜0.01）；與治對組相比，胃苓組和香砂組差異明顯（P＜0.05）；胃苓組和香砂組之間無明顯差異（P＞0.05）；與正常組相比，預防組、預對組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對組有顯著性差異（P＜0.01）。
　　5肝組織病理：各組大鼠肝組織膠原纖維面積百分比結(jié)果顯示：與模型組相比，正常組、預防組、預對組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對組差異顯著（P＜0.01）；預防組與預對組之間有明顯差異

12、（P＜0.05）；與預防組相比，香胃組、胃苓組、香砂組及治對組有顯著性差異（P＜0.01）；香胃組、胃苓組和香砂組之間無明顯差異（P＞0.05）；香胃組與預對組之間有顯著性差異（P＜0.01）；與治對組相比，香胃組、胃苓組和香砂組差異明顯（P＜0.05）；與正常組相比，預防組、預對組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對組有顯著性差異（P＜0.01）。
　　6小腸組織病理：模型組大鼠小腸黏膜上皮細胞變性、壞死，大量絨毛脫落，固有層裸露，腸

13、黏膜損傷程度重；預防組與預對組大鼠小腸黏膜絨毛頂端上皮下可見囊狀間隙，腸黏膜損傷程度輕，兩組比較，預防組更輕；香胃組、香砂組與胃苓組大鼠小腸黏膜上皮少數(shù)絨毛頂端脫落，固有層明顯水腫。香胃組與香砂組、胃苓組比較，腸黏膜損傷程度輕，與預對組比較腸黏膜損傷程度重；治對組小腸黏膜損傷程度介于模型組與治療組之間。
　　7肝組織α-SMA、TLR4、NF-κB免疫組化半定量及 TLR4mRNA、MyD88mRNA和NF-κB mRNA表達結(jié)果

14、：與模型組相比，正常組、預防組、預對組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對組差異性顯著（P＜0.01）。預防組與預對組之間有明顯差異（P＜0.05）；與預防組相比，香胃組、胃苓組、香砂組及治對組有顯著性差異（P＜0.01）；香胃組、胃苓組和香砂組之間無明顯差異（P＞0.05）；香胃組與預對組之間有顯著性差異（P＜0.01）；與治對組相比，香胃組、胃苓組和香砂組差異明顯（P＜0.05或P＜0.01）；與正常組相比，預防組、預對組、香胃組、胃苓組

15、、香砂組及治對組有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。
　　8小腸組織S-IgA含量及Occludin mRNA表達結(jié)果：與模型組相比，正常組、預防組、預對組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對組差異明顯（P＜0.01）；預防組與預對組之間有明顯差異（P＜0.05）；與預防組相比，香胃組、胃苓組、香砂組及治對組有顯著性差異（P＜0.01）；與香胃組相比，胃苓組和香砂組差異明顯（P＜0.05）；與香胃組相比，預對組和治對組有顯著性差

16、異（P＜0.05或P＜0.01）；與治對組相比，胃苓組和香砂組差異明顯（P＜0.05）；胃苓組和香砂組之間無明顯差異（P＞0.05）；與正常組相比，預防組、預對組、香胃組、胃苓組、香砂組及治對組有顯著性差異（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　香胃聯(lián)合方組可以有效清除腸道內(nèi)毒素，改善腸黏膜通透性，明顯降低血漿內(nèi)毒素水平，減輕肝臟損傷，延緩大鼠肝硬化的進展，早期預防用藥效果更好。其作用機理可能為：
　　1香胃聯(lián)合方組通過減

17、少肝硬化大鼠血清D-乳酸、小腸脂肪酸結(jié)合蛋白水平，降低腸黏膜通透性，增加緊密連接Occludin蛋白表達，提高S-IgA的分泌水平，從而降低肝硬化大鼠血漿內(nèi)毒素水平。
　　2香胃聯(lián)合方組通過抑制血漿內(nèi)毒素引起的 TLR4-MyD88-NF-κB信號通路，下調(diào)TLR4蛋白、MyD88蛋白及NF-κB蛋白表達，減少血中TNF-α、Il-6和NO水平，從而減輕內(nèi)毒素對肝硬化大鼠肝臟的損害。
　　3香胃聯(lián)合方組通過改善肝功，減少血漿