腸源性內(nèi)毒素血癥對NASH大鼠的影響及其作用機(jī)制的探討.pdf

1、目的:
　　 建立高脂飲食的非酒精性脂肪肝炎((nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)大鼠動物模型，檢測大鼠內(nèi)毒素水平，并予口服布拉氏酵母菌散劑進(jìn)行干預(yù)，觀察通過改善腸道菌群，降低內(nèi)毒素血癥后，其肝臟脂肪變性和炎癥的變化，進(jìn)而探討這種變化是否通過肝臟清道夫受體A(scavengerreceptorA，SR-A)的變化發(fā)揮作用，為NASH的發(fā)病機(jī)制和治療提供新的理論依據(jù)。
　　 方法:
　

2、　 1、動物模型的制備將42只雄性SpragueDawley(SD)大鼠，體重180±20g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對照組(NG，n=14)、模型組(MG，n=14)和干預(yù)組(TB，n=14);正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)（88％普通飼料+10％豬油+2％膽固醇），于16周末各組分別隨機(jī)處死4只動物，進(jìn)行肝臟HE染色，組織病理學(xué)證實(shí)了非酒精性脂肪肝炎模型成功。自第17周起干預(yù)組給予布拉氏酵母菌散劑(78*10

3、8CFU/kg·d-1)灌胃，并繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)，同時(shí)對照組及模型組均予等體積蒸餾水灌胃，于24周末將所有大鼠一并處死。上述動物均自由進(jìn)食水，在環(huán)境溫度25±2℃、明暗各12h的實(shí)驗(yàn)室動物房飼養(yǎng)。
　　 2、觀察大鼠一般情況，應(yīng)用電子天平秤取大鼠體重及肝濕重，根據(jù)以下公式計(jì)算肝指數(shù):肝濕重/體重×100％。
　　 3、各組大鼠于腹腔內(nèi)注射10％水合氯醛，待麻醉后將其處死，無菌無熱源條件下于門靜脈采血，將血液置于在3000

4、r/min的離心機(jī)內(nèi)，離心15分鐘，分離血清采用鱟試劑檢測血清內(nèi)毒素水平;心臟采血分離血清采用全自動生化分析儀測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)水平。
　　 4、肝組織HE染色，光鏡下觀察肝臟病理學(xué)表現(xiàn)。
　　 5、采用免疫熒光法分別測定各組大鼠肝臟清道夫受體A(scavengerreceptorA，SR-A)蛋白的表達(dá)。
　　 6、采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定上述

5、各組大鼠肝臟SR-AmRNA，TNF-αmRNA水平。
　　 結(jié)果:
　　 1、各組大鼠體重、肝濕重和肝指數(shù):
　　 于16周末對部分大鼠處死，肝組織HE染色，證實(shí)大鼠NASH模型復(fù)制成功。
　　 模型組的大鼠體重、肝濕重、肝指數(shù)均明顯高于正常對照組的大鼠體重、肝濕重、肝指數(shù)（體重:567.60±18.9vs460.71±14.71，P＜0.05;肝濕重:19.68±2.68vs11.53±0.98，P＜

6、0.05;肝指數(shù):3.47±0.43vs2.50±0.12，P＜0.05）;與模型組相比，干預(yù)組的大鼠體重、肝濕重、肝指數(shù)均明顯降低(體重:521.50±19.4vs567.60±18.9，P＜0.05;肝濕重:15.06±1.32vs19.68±2.68，P＜0.05;肝指數(shù):2.89±0.20vs3.47±0.43，P＜0.05)。
　　 2、血清生化指標(biāo):
　　 與正常對照組相比，模型組的大鼠AST、ALT、TG均

7、明顯升高，(AST:276.95U/L±25.06U/Lvs145.37U/L±15.19U/L,P＜0.05;ALT:103.44U/L±8.41U/Lvs39.10U/L±6.01U/L,P＜0.05;TG:0.93mmol/L±0.14mmol/Lvs0.54mmol/L±0.10mmol/L，P＜0.05）;干預(yù)組的大鼠AST、ALT、TG與模型組相比均下降(AST:191.68U/L±14.62U/Lvs276.95U/L±2

8、5.06U/L,P＜0.05;ALT:71.02U/L±5.04U/Lvs103.44U/L±8.41U/L,P＜0.05;TG:0.73mmol/L±0.11mmol/Lvs0.93mmol/L±0.14mmol/L,P＜0.05)。
　　 3、血清內(nèi)毒素水平:
　　 模型組血清內(nèi)毒素水平與正常對照組相比明顯增加(0.36EU/ml±0.02EU/mlvs0.17EU/ml±0.01EU/ml，P＜0.05);而與模型

9、組相比，干預(yù)組血清內(nèi)毒素水平減少(0.22EU/ml±0.01EU/mlvs0.36EU/ml±0.02EU/ml，P＜0.05)。
　　 4、肝組織SR-A蛋白的表達(dá)水平:
　　 免疫熒光結(jié)果顯示:SR-A主要表達(dá)于肝臟枯否細(xì)胞(Kuffercells，KCs)及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上，綠色熒光為陽性表達(dá)。肝組織SR-A在正常對照組呈彌漫性表達(dá)，模型組肝臟的表達(dá)明顯減少，干預(yù)組肝組織SR-A的表達(dá)較模型組升高。
　　

10、5、肝組織SR-AmRNA、TNF-αmRNA的水平:
　　 模型組的大鼠肝組織SR-AmRNA水平與正常組相比顯著減少(0.52±0.32vs1.43±0.46，P＜0.05);而與模型組相比，干預(yù)組的大鼠肝組織SR-AmRNA增加(0.87±0.34vs0.52±0.32，P＜0.05)。
　　 與正常組相比，模型組的大鼠肝組織TNF-αmRNA水平明顯增加(1.56±0.35vs0.57±0.23，P＜0.05);

11、而與模型組相比，干預(yù)組的大鼠肝組織TNF-αmRNA水平減少(1.23±0.24vs1.56±0.35，P＜0.05)。
　　 6、肝臟病理學(xué)變化:
　　 肉眼觀:正常組的大鼠肝臟表面光滑，色澤鮮紅，邊緣銳利，質(zhì)韌;模型組大鼠肝臟體積彌漫性增大，包膜緊張，呈土黃色，邊緣鈍而厚，油膩感明顯，質(zhì)較硬;干預(yù)的大鼠肝臟色偏黃、質(zhì)地中等，邊緣稍鈍。
　　 光鏡下:正常組的大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，可見圍繞中央靜脈呈放射狀排列

12、的肝細(xì)胞索，肝細(xì)胞體積正常，界限清楚，中央可見大而圓的細(xì)胞核，胞漿均勻，無脂肪變性及炎性細(xì)胞浸潤;模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性，胞漿內(nèi)可見大小不等的脂肪空泡，并伴有程度不等的點(diǎn)灶狀壞死、匯管區(qū)及小葉內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，與正常組相比脂肪變性及炎癥明顯加重(NAS:6.90±0.57vs0.70±0.48，P＜0.05;);干預(yù)組中央靜脈周圍的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚存在，遠(yuǎn)離中央靜脈的肝細(xì)胞輕度脂肪變性，可見少量炎癥細(xì)胞浸潤，與模型組相比，

13、脂肪變性及炎癥程度減輕(NAS:3.60±0.71vs6.90±0.57，P＜0.05)。
　　 7、各項(xiàng)指標(biāo)間的Pearson's相關(guān)性分析:
　　 血清內(nèi)毒素水平與肝臟病理學(xué)評分及肝臟TNF-αmRNA的水平均呈正相關(guān)（r值分別為0.645、0.696，P＜0.05）;與肝組織SR-AmRNA的水平呈負(fù)相關(guān)（r值為-0.632，P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、高脂飲食可成功制備大鼠NASH模