七葉皂苷和多奈哌齊對(duì)鼠腦缺血損傷及血管性癡呆的作用.pdf

1、研究目的：腦血管疾病是危害人類生命健康的常見病和多發(fā)病，具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，是中老年人致死、致殘的主要疾病。 血管性癡呆是以認(rèn)知損害為特征的一種綜合征，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙，包括學(xué)習(xí)、記憶、思維功能的降低等。腦血管疾病，特別是缺血所致的腦損傷是導(dǎo)致血管性癡呆(vascular dementia，VD)的重要原因。 藥理學(xué)和臨床研究證明，包括多奈派齊在內(nèi)的膽堿酯酶抑制劑可明顯緩解癡呆病人的癥

2、狀，改善生活質(zhì)量。但由于膽堿酯酶抑制劑可引起以胃腸道癥狀為主的嚴(yán)重不良反應(yīng)，其臨床使用受到了很大的限制。 腦缺血損傷后產(chǎn)生的炎癥和水腫，以及隨之發(fā)生的神經(jīng)損傷與血管性癡呆發(fā)生密切相關(guān)。七葉皂苷鈉是從中藥娑羅子中提取的三萜皂苷類化合物，具有很強(qiáng)的抗炎抗水腫作用，臨床上廣泛用于腦血栓的治療。 本論文以七葉皂苷鈉和多奈哌齊為代表，研究抗炎和膽堿酯酶抑制劑對(duì)腦缺血損傷及血管性癡呆的作用，并對(duì)這兩種藥物使用中可能存在的不良反應(yīng)及其

3、防治進(jìn)行研究。 研究方法：本論文分為兩大部分。第一部分研究七葉皂苷鈉對(duì)缺血性腦損傷的作用及其機(jī)制；第二部分研究膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊的神經(jīng)保護(hù)作用及不良反應(yīng)的防治。 一、七葉皂苷鈉對(duì)缺血性腦損傷的作用及機(jī)制研究 1.采用兩種大鼠缺血性損傷模型研究七葉皂苷鈉對(duì)缺血致神經(jīng)損傷的影響。第一種采用經(jīng)典栓線致大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)方法造成局灶性腦缺血再灌注損傷，以Longa's神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分法檢測動(dòng)物神經(jīng)損傷程度；

4、以氯化四唑(TTC)染色法測定腦梗死面積百分比，觀察七葉皂苷鈉對(duì)腦缺血性損傷的保護(hù)作用。第二種采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎大鼠腦缺血模型，結(jié)扎后，靜脈注射七葉皂苷鈉，每天1次，連續(xù)給藥3天，進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶觀察；另取大鼠手術(shù)后，連續(xù)給藥3天，末次給藥6小時(shí)后，麻醉取腦，觀察線粒體結(jié)構(gòu)功能變化。 2.采用小鼠短暫性缺血致腦損傷(記憶障礙)模型研究七葉皂苷鈉對(duì)血管性癡呆學(xué)習(xí)記憶的影響。實(shí)驗(yàn)時(shí)分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉同時(shí)放血。假手術(shù)組只

5、分離頸總動(dòng)脈，不夾閉和放血。手術(shù)次日開始給藥，假手術(shù)組給予生理鹽水，陽性藥對(duì)照組給予多奈哌齊，實(shí)驗(yàn)組分別給予不同劑量的七葉皂苷鈉。連續(xù)給藥3天后，開始Morris迷宮訓(xùn)練，連續(xù)5天，記錄每只小鼠的記憶潛伏期等，評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶成績。取海馬，以比色法測定乙酰膽堿酯酶活性。 3.以腦含水量評(píng)價(jià)七葉皂苷鈉對(duì)大鼠缺血再灌注致腦水腫的影響。證明七葉皂苷鈉的抗缺腦水腫作用后，以大鼠足跖腫模型和小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性模型研究其抗炎抗水腫作用特點(diǎn)；

6、以去腎上腺大鼠研究七葉皂苷鈉抗炎作用和腎上腺皮質(zhì)激素的關(guān)系。 4.以基因芯片，研究觀察缺血和給藥對(duì)NFκB通路基因和神經(jīng)遞質(zhì)受體及調(diào)控因子基因水平的影響。以蛋白芯片，觀察缺血對(duì)NFκB通路蛋白表達(dá)的影響。 二、膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊的神經(jīng)保護(hù)作用及其不良反應(yīng)防治 胃腸運(yùn)動(dòng)功能亢進(jìn)是膽堿酯酶抑制劑引起消化道不良反應(yīng)的主要原因。胃排空和腸推進(jìn)常被用作觀察動(dòng)物胃腸運(yùn)動(dòng)的指標(biāo)。 1.以胃排空和小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)M

7、-受體阻斷劑溴丙胺太林對(duì)膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊增強(qiáng)胃腸運(yùn)動(dòng)所致的消化道不良反應(yīng)的影響。 2.以能降低多奈哌齊胃腸道不良反應(yīng)的溴丙胺太林的劑量，觀察溴丙胺太林對(duì)多奈哌齊治療效應(yīng)的影響。 采用小鼠短暫性腦缺血致?lián)p傷(記憶障礙)模型，研究多奈哌齊對(duì)血管性癡呆學(xué)習(xí)記憶的影響。手術(shù)次日開始給藥，假手術(shù)組動(dòng)物給予生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組分別給予陽性藥對(duì)照藥多奈哌齊，溴丙胺太林，溴丙胺太林和多奈哌齊。連續(xù)給藥3天后，開范始Morris迷宮訓(xùn)練

8、，連續(xù)5天，記錄每只小鼠的記憶潛伏期。 取固定區(qū)域的皮層，測定乙酰膽堿酯酶活性。 以學(xué)習(xí)記憶指標(biāo)，評(píng)價(jià)多奈哌齊對(duì)血管性癡呆的治療作用，以及溴丙胺太林對(duì)多奈哌齊治療作用的影響。 3.以基因芯片，研究缺血、膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊或溴丙胺太林和多奈哌齊聯(lián)用，對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)受體及調(diào)控因子基因水平的影響。 結(jié)果： 1.在大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)局灶性腦缺血再灌注損傷模型，七葉皂苷鈉可以明顯降低缺血所致神經(jīng)

9、功能評(píng)分的升高，降低缺血致壞死面積，表明七葉皂苷鈉對(duì)缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。 2.在大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型，七葉皂苷鈉改善腦缺血損傷所致的學(xué)習(xí)記憶障礙。這種保護(hù)與改善線粒體呼吸功能有關(guān)。連續(xù)3天靜脈注射七葉皂苷鈉0.9mg/kg可以抑制線粒體膜結(jié)構(gòu)和呼吸能力受損，升高呼吸能力(S3)，降低基礎(chǔ)氧耗(S4)，升高呼吸鏈活性(RCR)。 3.小鼠短暫性腦缺血致腦損傷模型研究顯示，七葉皂苷鈉可明顯改善缺血所致的學(xué)習(xí)

10、記憶障礙。七葉皂苷鈉對(duì)短暫性腦缺血損傷有一定的防護(hù)作用，但該作用與腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性無關(guān)。 4.七葉皂苷鈉具有明顯的抗缺血致腦水腫作用。 5.在大鼠足跖腫模型和小鼠毛細(xì)血管通透性模型，七葉皂苷鈉均具有較強(qiáng)的抗炎作用，其作用起效相對(duì)緩慢，但維持時(shí)間長達(dá)24h。七葉皂苷鈉無致胃腸粘膜損傷作用，對(duì)應(yīng)激性潰瘍形成具有一定的抑制作用。七葉皂苷鈉對(duì)體液免疫、細(xì)胞免疫均無抑制作用。在去腎上腺大鼠，七葉皂苷鈉不顯示抗炎作用，表明七葉皂

11、苷鈉的抗炎作用依賴于腎上腺的存在；但靜脈注射七葉皂苷鈉并不升高大鼠體內(nèi)皮質(zhì)酮的水平；低劑量的皮質(zhì)酮和七葉皂苷鈉均無抗炎作用，而低劑量聯(lián)合給藥顯示明顯的協(xié)同效應(yīng)，表明七葉皂苷鈉不是通過刺激腎上腺皮質(zhì)激素的的釋放發(fā)揮抗炎效應(yīng)，而可能是通過放大糖皮質(zhì)激素的抗炎效應(yīng)而顯示抗炎作用。 6.基因芯片研究顯示，缺血可致部分神經(jīng)遞質(zhì)和受體基因發(fā)生明顯變化，七葉皂苷鈉可在一定程度上調(diào)節(jié)這些變化。特別是NFκB通路相關(guān)的基因，七葉皂苷鈉下調(diào)致炎性和

12、致腦損傷相關(guān)的基因，上調(diào)腦損傷保護(hù)相關(guān)的基因水平。在缺血的晚期，對(duì)NFκB蛋白表達(dá)無直接抑制作用。 7.小鼠腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)顯示，多奈哌齊能夠明顯提高腸推進(jìn)速度，而溴丙胺太林明顯減慢腸推進(jìn)速度；以不同劑量的溴丙胺太林與多奈哌齊聯(lián)合使用，溴丙胺太林2mg/kg給藥時(shí)，可明顯緩解多奈哌齊所致的胃腸運(yùn)動(dòng)亢進(jìn)，表明適當(dāng)劑量的M-受體阻斷劑可以降低膽堿酯酶抑制劑對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的影響，降低消化道不良反應(yīng)的發(fā)生。 8.溴丙胺太林與多奈哌齊聯(lián)合使

13、用對(duì)多奈哌齊治療效應(yīng)影響研究顯示，短暫性腦缺血損傷可致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙：多奈哌齊對(duì)缺血致記憶障礙具有一定的改善作用；溴丙胺太林單獨(dú)使用對(duì)學(xué)習(xí)記憶障礙無明顯影響，與多奈哌齊聯(lián)合使用，不降低多奈哌齊的治療作用。腦缺血損傷后第8天，腦皮層的膽堿酯酶活性升高，多奈哌齊抑制膽堿酯酶的活性，溴丙胺太林不改變多奈哌齊對(duì)膽堿酯酶的抑制程度。表明多奈哌齊用藥的初始階段，選擇不易透過血腦屏障的M-受體阻斷劑與膽堿酯酶抑制劑聯(lián)合使用，既可降低膽堿酯酶抑制劑胃

14、腸道不良反應(yīng)，又不影響治療癡呆的藥理效應(yīng)。 9.在短暫性腦缺血小鼠，使用膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊、M-受體阻斷劑溴丙胺太林，或聯(lián)合使用兩種藥物，對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)受體及調(diào)控因子基因產(chǎn)生復(fù)雜的調(diào)節(jié)。缺血和藥物對(duì)膽堿酯酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)表現(xiàn)為，不影響乙酰膽堿酯酶基因水平；對(duì)膽堿能受體基因的調(diào)節(jié)十分復(fù)雜。短暫性腦缺血和藥物對(duì)膽堿能系統(tǒng)以外的受體如多巴胺、甘丙肽、神經(jīng)肽Y等也具有顯著的調(diào)節(jié)作用。 10.基因芯片研究的結(jié)果還顯示，缺血和藥物對(duì)遞質(zhì)

15、受體及調(diào)控因子基因發(fā)生復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。溴丙胺太林與多奈哌齊聯(lián)用與多奈哌齊單獨(dú)使用相比，基因水平上顯示了一定的差異。 結(jié)論： 1.七葉皂苷鈉對(duì)缺血性腦損傷具有保護(hù)作用，對(duì)腦缺血所致的學(xué)習(xí)記憶障礙具有改善作用。該作用可能與抗腦水腫，線粒體保護(hù)，減輕神經(jīng)損傷有關(guān)；而與乙酰膽堿酯酶活性無關(guān)。 2.七葉皂苷鈉對(duì)缺血海馬組織炎癥損傷因子如補(bǔ)體C3、趨化因子、TNF和CD40基因的下調(diào)和損傷保護(hù)因子GM-CSF基因的上調(diào)，可能

16、是其神經(jīng)損傷保護(hù)的重要機(jī)制。 3.七葉皂苷鈉的抗炎作用與糖皮質(zhì)激素相似。其抗炎作用依賴于腎上腺的存在，但并不刺激體內(nèi)糖皮質(zhì)激素的釋放，放大糖皮質(zhì)激素抗炎效應(yīng)可能是七葉皂苷鈉抗炎作用的重要機(jī)制。七葉皂苷鈉在發(fā)揮抗炎作用的同時(shí)，既不抑制機(jī)體的免疫功能，又不引起消化道粘膜的損傷，且對(duì)應(yīng)激性潰瘍有一定的防治作用，因此適合用于腦缺血疾病的治療。 4.多奈哌齊可改善缺血所致的學(xué)習(xí)記憶障礙。不易透過血腦屏障的季胺類M-受體阻斷劑溴丙胺

17、太林，可明顯降低多奈哌齊的消化道不良反應(yīng)，而對(duì)其治療學(xué)效應(yīng)無明顯影響。腦缺血、多奈哌齊、多奈派齊和溴丙胺太林兩者聯(lián)合使用對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)受體及調(diào)控因子基因產(chǎn)生復(fù)雜的影響。 本研究的意義與創(chuàng)新點(diǎn)是： 本研究明確了臨床常用于缺血性腦中風(fēng)治療的抗炎抗水腫藥物七葉皂苷鈉能夠降低缺血致癡呆的發(fā)生，明確了其抗炎作用的特點(diǎn)和初步機(jī)制，為科學(xué)合用藥奠定了理論基礎(chǔ)；明確了老年性癡呆治療藥物多奈哌齊早期給藥具有降低缺血致癡呆的作用，提出了解決膽堿

18、酯酶抑制劑消化道不良反應(yīng)的方案，為更合理地應(yīng)用膽堿酯酶抑制劑治療血管性癡呆提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)：(1)首次明確七葉皂苷鈉的神經(jīng)保護(hù)作用可以減少腦缺血引起的血管性癡呆的發(fā)生；(2)首次明確七葉皂苷鈉可以同時(shí)上調(diào)神經(jīng)損傷保護(hù)因子的基因，下調(diào)致炎癥損傷因子的基因；(3)首次提出七葉皂苷鈉放大糖皮質(zhì)激素抗炎效應(yīng)抗炎作用的新機(jī)制；(4)證明了不能透過血腦屏障的M-受體阻斷劑溴丙胺太林既可降低多奈哌齊的不良反應(yīng)，又不影響多奈哌齊的療