牦牛瘤胃厭氧真菌與甲烷菌共培養(yǎng)物的多樣性及其纖維降解特性研究.pdf

1、青藏高原牦牛終年以放牧方式生活在海拔3000米以上的極端生態(tài)環(huán)境，棲息在瘤胃中的大量微生物使牦牛瘤胃成為高效降解木質(zhì)纖維素的天然發(fā)酵罐。其中，厭氧真菌是一種重要的木質(zhì)纖維素降解微生物。有研究認(rèn)為，與瘤胃真菌共生的一些甲烷菌能夠提高厭氧真菌纖維素降解活性，并促進(jìn)木質(zhì)纖維素降解代謝轉(zhuǎn)化生成乙酸和甲烷。目前有關(guān)瘤胃厭氧真菌和甲烷菌之間的自然共存關(guān)系研究報(bào)道很少，為開發(fā)利用瘤胃內(nèi)高效降解木質(zhì)纖維素的優(yōu)質(zhì)真菌資源，本文首次以甘肅省天祝放牧牦牛為研

2、究對(duì)象，利用亨氏厭氧滾管培養(yǎng)技術(shù)，分離獲得了大量瘤胃厭氧真菌及甲烷菌自然共培養(yǎng)物，分析探討了厭氧真菌和甲烷菌之間的自然共存關(guān)系，并開展了這些共培養(yǎng)物對(duì)農(nóng)作物秸稈的木質(zhì)纖維素降解功效和消化代謝研究，主要研究結(jié)果如下：
　　1.牦牛瘤胃共培養(yǎng)物的多樣性：自天祝全放牧牦牛瘤胃食糜液中分離獲得生長(zhǎng)穩(wěn)定的厭氧真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物20個(gè)，通過形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS1序列分析鑒定厭氧真菌的種屬，通過PCR-DGGE技術(shù)和16SrDNA序列分析與厭氧真

3、菌共生的甲烷菌的多樣性和種類。20個(gè)共培養(yǎng)物包括4種組合類型：8個(gè)Orpinomyces joyonii+Methanobrevibacter ruminantium，1個(gè)Orpinomyces joyonii+Methanobrevibacter millerae，8個(gè) Neocallimastix frontalis+Methanobrevibacter ruminantium，3個(gè)Piromyces+Methanobrevibac

4、ter ruminantium。
　　2.高效共培養(yǎng)物的篩選：以小麥秸稈為生長(zhǎng)底物，通過檢測(cè)產(chǎn)氣量、多糖水解酶活性、酯酶活性、干物質(zhì)降解率、酚酸釋放量、甲烷和乙酸產(chǎn)量，研究發(fā)現(xiàn)8個(gè)共培養(yǎng)Neocallimastix frontalis+Methanobrevibacter ruminantium和3個(gè)共培養(yǎng) Piromyces+Methanobrevibacter ruminantium比9個(gè)共培養(yǎng) Orpinomyces joy

5、onii+Methanobrevibacter ruminantium生長(zhǎng)更加穩(wěn)定快速，表現(xiàn)出更強(qiáng)的秸稈纖維降解活性。自20個(gè)3屬真菌與甲烷菌共培養(yǎng)中，篩選出降解秸稈的3個(gè)高效共培養(yǎng)物分別為：O. joyonii Yak7+M. ruminantium。N. frontalis Yak16+M. ruminantium和Piromyces Yak18+M. ruminantium。
　　3．高效共培養(yǎng)和相應(yīng)的真菌純培養(yǎng)對(duì)秸稈的降解

6、能力比較：在上述2研究的基礎(chǔ)上，以小麥秸稈、玉米秸稈、水稻秸稈為底物，在7天培養(yǎng)期內(nèi)，3個(gè)高效共培養(yǎng)物中N. frontalis Yak16+M. ruminantium表現(xiàn)出最強(qiáng)的降解秸稈木質(zhì)纖維素功能，產(chǎn)生最高活性木聚糖酶、濾紙纖維素酶、阿魏酸酯酶、乙酰酯酶、香豆酸酯酶、最高干物質(zhì)降解率、中性和酸性洗滌纖維降解率和最多的酚酸釋放量。甲烷菌M. ruminantium在不同程度上提高了3株厭氧真菌純培養(yǎng)降解秸稈的功能，尤其是真菌純培養(yǎng)

7、N. frontalis Yak16本身以3種秸稈為底物具有較高干物質(zhì)降解率，而與甲烷菌M. ruminantium形成自然共培養(yǎng)后進(jìn)一步顯著提高了真菌純培養(yǎng)N. frontalis Yak16的降解功能，使共培養(yǎng)物N. frontalis Yak16+M. ruminantium成為高效降解秸稈木質(zhì)素纖維素的最佳優(yōu)勢(shì)組合，最高值分別達(dá)到：以麥秸為底物木聚糖酶12500 mU，以玉米秸為底物濾紙酶430.3 mU，阿魏酸酯酶11.0 m

8、U，乙酰酯酶199.3 mU，香豆酸酯酶5.0 mU，中性洗滌纖維降解率61.7％，酸性洗滌纖維降解率55.7%，阿魏酸釋放24.1 ug/mL和p-香豆酸釋放50.3μg/mL，以稻秸為底物的干物質(zhì)降解率71.9%。
　　4.高效共培養(yǎng)物和相應(yīng)的真菌純培養(yǎng)降解秸稈所產(chǎn)代謝產(chǎn)物比較：在上述3研究的基礎(chǔ)上，以小麥秸稈、玉米秸稈、水稻秸稈為底物，在7天培養(yǎng)期內(nèi)，3個(gè)高效共培養(yǎng)物相對(duì)應(yīng)的3個(gè)純培養(yǎng)真菌產(chǎn)生乙酸、乳酸、乙醇和氫氣產(chǎn)量依次是

9、N. frontalis Yak16﹥Piromyces Yak18﹥O. joyonii Yak7，尤其是厭氧真菌純培養(yǎng)N. frontalis Yak16產(chǎn)生大量乙醇和乳酸，乙醇產(chǎn)量遠(yuǎn)高于以前文獻(xiàn)報(bào)道。3個(gè)高效共培養(yǎng)產(chǎn)生乙酸、乳酸和甲烷產(chǎn)量依次是：N. frontalis Yak16+M. ruminantium﹥Piromyces Yak18+M. ruminantium﹥O. joyonii Yak7+M. ruminantiu

10、m，尤其是共培養(yǎng)N. frontalis Yak16+M. ruminantium產(chǎn)生大量乙酸和甲烷，歸因于甲烷菌M. ruminantium改變了厭氧真菌的代謝途徑。根據(jù)上述結(jié)果，無論是厭氧真菌純培養(yǎng) N. frontalis Yak16，還是厭氧真菌及甲烷菌共培養(yǎng) N. frontalis Yak16+M. ruminantium都可能在提高木質(zhì)纖維素生物降解中具有重要的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。
　　綜上所述，本文系統(tǒng)揭示了天祝放牧牦牛