降脂益肝沖劑預(yù)防和治療大鼠非酒精性脂肪性肝病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種遺傳--環(huán)境--代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病，與胰島素抵抗及其相關(guān)的代謝綜合征和遺傳易感性密切相關(guān)?！岸未驌簟睂W(xué)說(shuō)認(rèn)為胰島素抵抗和氧應(yīng)激/脂質(zhì)過(guò)氧化損傷是NAFLD發(fā)病的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此，當(dāng)前防治NAFLD的醫(yī)學(xué)研究文獻(xiàn)多集中于胰島素抵抗和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷兩個(gè)方面上，其中胰島素抵抗是NAFLD的觸發(fā)因素，脂質(zhì)代謝平衡紊亂是它的起始環(huán)節(jié)。由于單純性脂肪肝是一種良性可逆性疾病，因此采取有效治療手段提高胰島

2、素的敏感性，糾正脂質(zhì)代謝紊亂，是早期防治NAFLD的重點(diǎn)。當(dāng)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的損害超過(guò)肝臟自身防御能力時(shí)，肝臟就會(huì)從單純脂肪變發(fā)展成為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。且非酒精性脂肪性肝病必須通過(guò)非酒精性脂肪性肝炎這一中間過(guò)度階段才能進(jìn)展為肝硬化。因此積極治療NASH，可有效防止其發(fā)展為肝硬化和肝癌，改善NAFLD的預(yù)后。目前的研究顯示過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPARa)可通過(guò)對(duì)肝內(nèi)脂肪酸氧化和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控，

3、在肝臟脂類代謝和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其功能缺陷不僅可引起肝細(xì)胞脂肪變性，還與NASH、肝硬化和肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。同時(shí)最新的研究還發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白(Trx)不僅與NAFLD的嚴(yán)重度相關(guān)，還與PPARα的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細(xì)胞PPARa及Trx的表達(dá)變化，研究其在NAFLD發(fā)病中的作用及相關(guān)性，并探討降脂益肝沖劑預(yù)防和治療NAFLD的藥效及機(jī)制。 方法：健康Wistar雄鼠

4、56只，隨機(jī)分為7組：正常對(duì)照組(N)、模型Ⅰ組(M1)、模型Ⅱ組(M2)、模型Ⅲ組(M3)和中藥Ⅰ組(D1)、中藥Ⅱ組(D2)、中藥Ⅲ組(D3)，每組各8只大鼠。除正常組給予普通飼料喂養(yǎng)外，其余各組均飼喂高脂飲食。其中中藥Ⅰ組于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始給予高脂飼養(yǎng)的同時(shí)中藥灌胃8周，8周末與正常組和模型Ⅰ組共同處死；中藥Ⅱ組則在高脂飼養(yǎng)8周后中藥灌胃5周，于13周末同模型Ⅱ組共同處死；中藥Ⅲ組則在高脂飼養(yǎng)13周后中藥灌胃5周，于18周末同模型Ⅲ組共同

5、處死。 測(cè)體重、體長(zhǎng)，并計(jì)算肝指數(shù)(肝濕重/體重×100％)、Lee's指數(shù)(體重<'0.33>/體長(zhǎng)×1000)等體質(zhì)指標(biāo)；全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血脂及肝組織脂質(zhì)含量；葡萄糖氧化酶法測(cè)定空腹血糖(FBG)，銅染色法測(cè)定血清和肝組織游離脂肪酸(FFA)水平，放免法測(cè)定血清空腹胰島素(FINs)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI=1/FINS×FBG)；

6、黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清和肝組織SOD活性；硫代巴比妥酸法測(cè)定血清和肝組織MDA含量；光鏡下評(píng)估脂肪變性和炎癥活動(dòng)情況；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定PPAR α和Trx m RNA的表達(dá)。 結(jié)果：8周后模型Ⅰ組大鼠出現(xiàn)了明顯的脂質(zhì)代謝紊亂，伴隨高胰島素血癥和胰島素抵抗；血清轉(zhuǎn)氨酶水平較正常組明顯升高，TNF-α水平升高；肝組織中SOD活力較正常組無(wú)明顯差異，MDA含量較正常組大鼠雖有所升高，但與正常大鼠相比亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

7、(P值均>0.05)；此時(shí)肝臟出現(xiàn)了輕到中度脂肪變，但無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。說(shuō)明胰島素抵抗在NAFLD發(fā)病初期肝細(xì)胞脂肪變性過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，而氧應(yīng)激在此時(shí)并未發(fā)揮主要作用；模型Ⅰ組和中藥Ⅰ組PPARa mRNA表達(dá)較正常組明顯升高，且中藥Ⅰ組升高的更為明顯(P值分別為<0.05和<0.01)，Trx mRNA的表達(dá)明顯降低，此時(shí)PPARα mRNA和Trx mRNA表達(dá)的相關(guān)分析顯示兩者無(wú)相關(guān)關(guān)系。中藥Ⅰ組大鼠血清和肝組織脂質(zhì)含量較模型Ⅰ組

8、均有明顯改善，同時(shí)反映胰島素抵抗的胰島素敏感指數(shù)也較模型Ⅰ組顯著升高；TNF-α、轉(zhuǎn)氨酶水平、MDA含量較模型Ⅰ組明顯降低，肝組織PPARα mRNA表達(dá)顯著升高(P值分別為<0.01和<0.05)，肝組織脂變程度較模型組明顯減輕(P<0.05)。 13周后，和正常組大鼠相比，模型Ⅱ組大鼠胰島素抵抗程度、血脂和肝臟脂質(zhì)含量、血清TNF-α含量、轉(zhuǎn)氨酶水平明顯升高；肝組織MDA含量明顯升高的同時(shí)， SOD活力明顯降低，肝組織出現(xiàn)中到重度脂

9、肪變，肝小葉內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)和散在的點(diǎn)狀壞死，炎癥活動(dòng)度計(jì)分明顯高于正常組(P<0.01)。說(shuō)明氧應(yīng)激在肝脂肪變性后進(jìn)一步發(fā)展為炎癥過(guò)程中起到重要作用；同時(shí)模型Ⅱ組PPARα mRNA表達(dá)較模型Ⅰ組略有下降，但仍高于正常組，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值>0.05)；肝組織Trx mRNA表達(dá)較模型Ⅰ組顯著升高(P<0.01)但仍然低于正常組；此時(shí)PPARa mRNA和Trx mRNA表達(dá)相關(guān)分析表明兩者呈負(fù)相關(guān)(γ=-0.802，P<0.05)

10、。中藥Ⅱ組大鼠胰島素抵抗及脂質(zhì)代謝紊亂有明顯改善，血清轉(zhuǎn)氨酶、TNF-α水平較模型Ⅱ組明顯降低；肝組織MDA含量明顯降低， SOD活力則較模型Ⅱ組顯著升高；此時(shí)中藥Ⅱ組PPARα的表達(dá)較模型Ⅱ組升高顯著(P值<0.01)；肝組織脂變程度也較模型組明顯減輕(P<0.05)，炎癥活動(dòng)度也明顯減輕(P<0.01)。 18周后，和正常組大鼠相比，模型Ⅲ組大鼠胰島素抵抗程度血脂和肝臟脂質(zhì)含量、血清TNF-α含量、轉(zhuǎn)氨酶水平明顯升高；肝組織

11、MDA含量明顯升高， SOD活力明顯降低；肝組織出現(xiàn)彌漫性脂肪變性及氣球樣變性，其炎癥和壞死程度均較13周末的模型Ⅱ組重，炎癥活動(dòng)度計(jì)分明顯高于正常組(P<0.01)；此時(shí)肝組織PPARα mRNA表達(dá)較正常組明顯下降(P值<0.01)，Trx mRNA表達(dá)較模型Ⅱ組顯著升高(P<0.01)但仍然低于正常組；PPARα mRNA和Trx mRNA表達(dá)相關(guān)分析表明兩者呈負(fù)相關(guān)(γ=-0.82，P<0.05)。中藥Ⅲ組大鼠血脂和肝臟脂質(zhì)含量

12、、血清TNF-α含量、轉(zhuǎn)氨酶水平較模型組明顯降低；肝組織MDA含量明顯降低， SOD活力、ISI值則較模型組明顯升高；肝組織PPARα mRNA表達(dá)明顯升高；肝組織脂變及氣球樣變程度明顯減輕(P<0.01)，炎癥活動(dòng)度也明顯減輕(P<0.01)。 結(jié)論： 1．證實(shí)了胰島素抵抗和氧應(yīng)激/脂質(zhì)過(guò)氧化損傷是NAFLD發(fā)生過(guò)程中的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)； 2．PPARα的表達(dá)減弱與NAFLD的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切； 3．Tr