非酒精性脂肪性肝病大鼠肝組織microRNA表達(dá)譜的分析.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)旨在篩查非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liverdisease，NAFLD)大鼠肝組織中差異表達(dá)的微小RNA(microRNA，miRNA)，為NAFLD的早期干預(yù)、診斷、治療提供生物學(xué)標(biāo)記，也為進(jìn)一步研究miRNA以何種方式作用于細(xì)胞凋亡過程奠定基礎(chǔ)。
　　方法:取SD大鼠16只（4周齡、每只重約200g、雄性），經(jīng)適應(yīng)性飼喂1周后，隨機(jī)分成對照組（命名為為E組，共8只）及模型組（命名為

2、為Y組，共8只），E組采用普通飼料喂養(yǎng)，Y組給予高糖、高脂飼料喂養(yǎng)，共喂養(yǎng)12周以建立非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)模型。12周末處死兩組，各取肝臟組織進(jìn)行HE染色的病理學(xué)檢查（以觀察各組肝臟脂肪樣變、炎癥活動(dòng)程度并進(jìn)行組織學(xué)評分），隨后經(jīng)腹腔腹主動(dòng)脈取血，使用全自動(dòng)生化分析儀，采用酶法測定血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartateaminotransferase，AST）、

3、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽固醇(total cholesterol，TG)、總甘油三酯(total triglyceride，TC)和空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)的水平;然后，E組和Y組隨機(jī)各取3只大鼠，采用Trizol法分別提取各新鮮樣本的總RNA，經(jīng)NanoDrop2000和Agilent Bioanalyzer2100質(zhì)檢合格后采用Affy

4、metrix miRNA表達(dá)譜芯片GeneChip miRNA4.0進(jìn)行miRNA的檢測，根據(jù)芯片結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)篩選miRNA使用實(shí)時(shí)定量PCR以驗(yàn)證。
　　結(jié)果:1.一般情況:造模過程中，E組大鼠喜動(dòng)、活躍，毛發(fā)干凈、光澤，體重逐步增加;Y組大鼠精神萎靡、少動(dòng)，毛發(fā)亂、光澤度差，進(jìn)食少，體重增加較緩慢。2.肝指數(shù)變化:與E組相比，Y組大鼠的體重、肝濕重?zé)o明顯變化(P＞0.05)，而肝指數(shù)增加顯著(P＜0.05)。3.生化指標(biāo):相

5、較于E組，Y組大鼠ALT、TG、TC、FPG四項(xiàng)指標(biāo)未見顯著變化(P＞0.05)，而AST升高明顯(P＜0.05)。4.肝臟組織HE染色:Y組大鼠的肝臟可見重度脂肪樣變性，甚至發(fā)生氣球樣變，伴肝細(xì)胞的點(diǎn)、灶狀壞死，周圍有多種炎細(xì)胞浸潤。5.miRNA芯片結(jié)果:與E組相比，Y組有10個(gè)變化倍數(shù)在2倍以上的差異性表達(dá)的miRNA(P＜0.05)。Y組中rno-miR-743a-3p、rno-miR-741-3p、rno-miR-101a-3

6、p、rno-miR-29b-3p、rno-miR-871-3p表達(dá)明顯升高; rno-miR-344g、rno-miR-183-5p、rno-miR-32-3p、rno-miR-182、rno-mir-182表達(dá)明顯降低。6.綜合miRNA芯片結(jié)果及結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)，選擇miR-182、miR-29b-3p、miR-741-3p進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，與E組相比，Y組中miR-182、miR-29b-3p、miR-741-3p

7、的表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，與基因芯片結(jié)果基本一致。
　　結(jié)論:1.高糖高脂飲食是NAFLD的病因，采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)可安全、高效的建立NAFLD動(dòng)物模型;2.采用高糖、高脂飲食喂養(yǎng)建立的NAFLD大鼠，其miRNA表達(dá)譜較正常組有顯著改變，表明這些差異性表達(dá)miRNA可能在NAFLD的發(fā)病進(jìn)程中發(fā)揮作用，但其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步探索;3.采用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證miR-182、miR-29b-3p、miR-741-3p的表達(dá)，