殼聚糖球形多孔微載體制備及其肝細(xì)胞培養(yǎng)的初步研究.pdf

1、生物人工肝(Bioartificial liver, BAL)支持系統(tǒng)核心問題是高活性、高密度肝細(xì)胞的培養(yǎng)。近些年來，雖然有許多培養(yǎng)方式用于生物人工肝研究，如中空纖維管培養(yǎng)、膠原固定培養(yǎng)、球形聚集體培養(yǎng)和微囊包裹等培養(yǎng)方式，但這些方法都存在著一定程度的不足。微載體(Microcarrier，MC)培養(yǎng)被認(rèn)為目前是高密度培養(yǎng)動物細(xì)胞的一種有效方法，也在生物工程中也得到了廣泛應(yīng)用，其多為實(shí)心微載體。雖然目前研究和應(yīng)用的大孔或多孔實(shí)心微載體具

2、有許多優(yōu)點(diǎn)，但是同樣與理想中的生物人工肝所需研究的細(xì)胞高密度培養(yǎng)方法相差甚遠(yuǎn)。所謂理想中“真正的”多孔微載體是具有與體內(nèi)細(xì)胞三維環(huán)境生長相似的結(jié)構(gòu)，即為內(nèi)外都有孔，孔與孔之間有連接，內(nèi)外孔相通，孔徑相近，并且更需要那種適合細(xì)胞自由出入、能正常高活性的生長的孔，這樣由于其比表面積大大的增加，將有利于黏附更多的細(xì)胞，多孔結(jié)構(gòu)更有利于營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸和細(xì)胞的生長。目前有關(guān)多孔微載體的報道也極少，尚需進(jìn)一步研究和開發(fā)。 當(dāng)前用來制備微載體

3、(MC)的技術(shù)有：乳化交聯(lián)法、凝聚/沉淀法、噴霧干燥法、離子凝聚法、反相膠束法、乳液液滴凝聚法、濾篩法等。然而，這些技術(shù)制備的微載體大多是實(shí)心，其幾何形狀、大小和孔壁厚度都無法精確控制，所得微載體的分散性與穩(wěn)定性不佳，其物理機(jī)械強(qiáng)度較差等缺點(diǎn)。最大的弊端在于，其制備的微載體比表面積較為局限，從而限制了其高密度、高活性地進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。另外，目前用來制備微載體的材料也很多，其中殼聚糖(Chitosan)是甲殼素的脫乙酰衍生物，是自然界唯一的

4、堿性天然氨基多糖，其來源豐富、廉價，分子中含有帶正電荷的氨基基團(tuán)，且具有良好的生物親和粘附性、相容性、功能性、低毒性、降解性、幾乎無過敏性等。 本課題采納相關(guān)文獻(xiàn)報道的研究經(jīng)驗和成果，在以往的研究工作基礎(chǔ)上，進(jìn)行了大量的理論考證和預(yù)實(shí)驗，擬以殼聚糖為材料，采用液氮冷凍干燥技術(shù)制備球形多孔微載體，利用掃描電子顯微鏡(SEM)等技術(shù)對其形態(tài)、物理和化學(xué)特性進(jìn)行了表征。其次，對制備和表征成功的多孔微載體生物相容性進(jìn)行評價，包括血液相容

5、性(利用溶血、凝血、血小板計數(shù)、血小板聚集試驗)和組織相容性(利用細(xì)胞毒性、全身急性毒性、熱原、皮膚刺激試驗)的評價。最后，本研究將利用制備成功的殼聚糖球形多孔微載體進(jìn)行人肝細(xì)胞L-02的培養(yǎng)，并對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行檢測和評價，包括形態(tài)學(xué)的觀察(細(xì)胞計數(shù)、倒置顯微鏡觀察、掃描電子顯微鏡觀察)和肝細(xì)胞功能(谷草轉(zhuǎn)氨酶，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶水平)及其代謝活性(白蛋白、尿素、葡萄糖含量)的測定。 結(jié)果顯示如下：本研究成功地制備出殼聚糖球

6、形多孔微載體，成球率>90％，內(nèi)外多孔且相互連通，孔徑在20～80μm之間，具有一定的密度、彈性、溶脹性、親和性和形態(tài)結(jié)構(gòu)，并具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、穩(wěn)定性和較大的比表面積；此微載體溶血率結(jié)果小于5％，凝血試驗、血小板計數(shù)及聚集試驗結(jié)果顯示前后比較無顯著性差異(P>0.05)，細(xì)胞毒性、全身急性毒性、熱原和皮膚刺激試驗結(jié)果均為陰性，表明此微載體符合生物醫(yī)學(xué)材料的評價標(biāo)準(zhǔn)，其具有良好的生物相容性；利用此微載體成功地黏附培養(yǎng)了人肝細(xì)胞L-02，

7、并且與無微載體相比，培養(yǎng)的肝細(xì)胞具有較好的形態(tài)，且肝細(xì)胞的數(shù)量、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)、白蛋白(ALB)分泌的濃度、尿素(UREA)合成量和葡萄糖(GLUCOSE)，消耗量均始終明顯高于后者(P<0.05)，表明此微載體培養(yǎng)的人肝細(xì)胞L-02更具有高密度、高效性和較高的功能、代謝活性。 所以，殼聚糖球形多孔微載體制備及其人肝細(xì)胞培養(yǎng)的初步研究成功，本研究成果為微載體在體外三維環(huán)境下肝細(xì)胞