褪黑素保護(hù)鎘暴露所致肝毒性效應(yīng)的機(jī)制探討.pdf

1、背景：
　　褪黑素是一種在哺乳動物和人體體內(nèi)主要由松果體分泌的吲哚胺類激素，其在人體內(nèi)有著促進(jìn)睡眠、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等廣泛的生物學(xué)作用。重金屬元素鎘（Cadmium），由于其在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛的應(yīng)用及環(huán)境中的廣泛的存在，在職業(yè)作業(yè)環(huán)境中常能引起職業(yè)暴露，引起職業(yè)人群的健康危害；同時，因為其可以在食物鏈內(nèi)傳遞的特性，最后可以通過消化道或者呼吸道途徑富集于人體，導(dǎo)致非職業(yè)人群的健康危害。鎘離子在被機(jī)體攝入后，首先在血液中與白蛋白

2、結(jié)合后，通過循環(huán)系統(tǒng)被運輸?shù)礁闻K中。經(jīng)過肝臟的解毒作用，鎘離子可以少部分通過與谷胱甘肽（GSH）結(jié)合，經(jīng)過膽汁排泄；但其大部分在肝臟內(nèi)誘導(dǎo)金屬硫蛋白（MT）生成，再與之相結(jié)合，透過腎小球基底膜，部分通過尿液排泄，更多的是蓄積在腎臟內(nèi)，危害人體健康。因此肝臟是急性鎘暴露造成機(jī)體損傷的公認(rèn)的主要靶器官之一，但是其損傷機(jī)制目前尚未完全明確。線粒體是鎘離子進(jìn)入細(xì)胞后作用的主要靶器官之一，研究報道鎘離子可以造成線粒體腫脹、活性氧生成水平增加、線粒

3、體 DNA突變幾率增加和線粒體膜電位降低等損傷，最終會造成線粒體功能障礙。而已有許多報道稱線粒體功能障礙是許多疾病的重要病因，因為我們猜測在鎘急性暴露引起肝毒性中線粒體功能障礙同樣起了重要作用。線粒體生成水平是影響線粒體功能狀態(tài)的重要因素。PGC-1α（Peroxisome proliferator–activated receptorγcoactivator-1 alpha）是涉及到線粒體生成關(guān)鍵步驟中的重要因素，其上游信號分子SIR

4、T1能夠通過調(diào)節(jié)PGC-1α的乙?；癄顟B(tài)及活性水平來調(diào)節(jié)其在細(xì)胞內(nèi)的功能狀態(tài)，進(jìn)一步影響線粒體生成及功能狀態(tài)。有報道稱褪黑素能夠保護(hù)鎘暴露所導(dǎo)致的肝毒性，除了作為抗氧化劑能夠直接清除自由基外，其是否涉及到其他機(jī)制尚不明確?；谝陨戏治?，本研究旨在以線粒體功能改變和線粒體生成為切入點，通過細(xì)胞水平的實驗，明確鎘暴露引起線粒體功能障礙和線粒體生成受損在鎘的肝毒性中的作用；通過明確褪黑素對鎘的肝毒性的保護(hù)作用及對SIRT1/PGC-1α信號通

5、路和褪黑素受體1（Melatonin Receptor1，MT1）的影響，揭示褪黑素對于鎘的肝毒性的保護(hù)機(jī)制。
　　內(nèi)容：
　?、僖訦epG2細(xì)胞為模型，通過建立含有不同濃度梯度的氯化鎘（CdCl2）的培養(yǎng)基，構(gòu)造鎘暴露損傷模型，以細(xì)胞活力評估鎘暴露對肝細(xì)胞的損傷作用；以活性氧生成和線粒體膜電位水平評估鎘暴露對線粒體功能狀態(tài)的影響；以線粒體DNA拷貝數(shù)和線粒體質(zhì)量評估鎘暴露對線粒體生成的影響；
　?、谠谏弦徊街薪⒌逆k

6、暴露模型基礎(chǔ)上，加上褪黑素這種對線粒體功能有確切保護(hù)效應(yīng)的化合物預(yù)處理，評價其在鎘暴露中是否存在有保護(hù)作用；評估鎘及褪黑素預(yù)處理對于SIRT1及PGC-1α表達(dá)的影響，初步探討褪黑素對鎘暴露的保護(hù)機(jī)制；
　　③在上一步中建立的鎘暴露模型基礎(chǔ)上，通過 SIRT1特異性抑制劑Sirtinol及SIRT1 siRNA對細(xì)胞內(nèi)SIRT1分子進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)一步探討褪黑素保護(hù)鎘暴露所致肝毒性的是否通過SIRT1/PGC-1α信號通路；通過加用褪

7、黑素受體拮抗劑影響褪黑素受體功能，進(jìn)一步探討褪黑素的保護(hù)作用是否依賴于褪黑素受體機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　①濃度為2.5μM的鎘暴露并不能對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活力、活性氧生成、線粒體膜電位水平、線粒體DNA拷貝數(shù)及線粒體質(zhì)量產(chǎn)生影響。但是5μM及10μM的鎘暴露劑量即能對細(xì)胞活力、線粒體功能及線粒體生成產(chǎn)生毒性作用。
　?、谠?μM的鎘暴露劑量下，加用0.5μM的褪黑素預(yù)處理兩小時后，可以觀察到HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活力

8、、活性氧生成、線粒體膜電位水平、線粒體DNA拷貝數(shù)及線粒體質(zhì)量較單純鎘暴露組有明顯的上升。鎘處理能夠明顯的抑制SIRT1的表達(dá)，增加乙?；疨GC-1α的水平；而褪黑素預(yù)處理后鎘暴露所導(dǎo)致的SIRT1表達(dá)降低及乙酰化PGC-1α水平增加都有明顯的抑制。
　?、墼谏弦徊浇⒌耐屎谒乇Ｗo(hù)鎘暴露模型上，加用SIRT1特異性抑制劑Sirtinol及SIRT1 siRNA干擾HepG2細(xì)胞內(nèi)SIRT1的表達(dá)及活性后，褪黑素對于鎘暴露干擾細(xì)胞活

9、力、線粒體功能及線粒體生成的保護(hù)作用較單純褪黑素預(yù)處理組有明顯的下降，同時乙?；疨GC-1α水平也有所上升。在加用褪黑素受體拮抗劑Luzindole以后，褪黑素對于因鎘暴露所抑制的SIRT1表達(dá)及增強(qiáng)的乙酰化PGC-1α的保護(hù)作用也有部分的下降。
　　結(jié)論：
　　根據(jù)本課題的研究結(jié)果，我們可以獲得以下結(jié)論：鎘離子在進(jìn)入細(xì)胞后引起的線粒體功能障礙及生成受損可能是其在急性暴露過程中造成肝毒性的重要原因。鎘通過干擾線粒體的功能生成