生長因子基因活化基質(zhì)材料在促進(jìn)自體韌帶移植愈合中的體內(nèi)外應(yīng)用研究.pdf

1、第一部分：血小板衍化生長因子基因活化材料的制備及生物活性檢測
　　 目的：構(gòu)建含有人血小板衍化生長因子-B(hPDGF-B)基因片段的真核表達(dá)質(zhì)粒，并利用兔成纖維細(xì)胞做生物活性檢測。
　　 方法：應(yīng)用基因重組技術(shù)和限制性內(nèi)切酶雙酶切構(gòu)建并鑒定EGFP-N1-hPDGF-B真核表達(dá)載體，體外培養(yǎng)兔成纖維細(xì)胞，傳代培養(yǎng)后用陽離子脂質(zhì)體(LipofectAMINE)：EGFP-N1-hPDGF-B為3μL∶1μg的比例轉(zhuǎn)染，G

2、418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。通過RT-PCR和熒光法檢測PDGF-B表達(dá)水平；利用四甲基偶氮唑法檢測PDGF-B的生物學(xué)活性繪制成纖維細(xì)胞生長曲線。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建含EGFP-N1-PDGF-B基因的真核表達(dá)載體，經(jīng)RT-PCR檢測了PDGF-B在轉(zhuǎn)錄水平mRNA的表達(dá)情況，熒光法檢測目標(biāo)基因成功轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞呈強陽性表達(dá)，并持續(xù)4周以上。
　　 結(jié)論：重組真核表達(dá)載體構(gòu)建正確，并能在成纖維細(xì)胞

3、中表達(dá)PDGF-B mRNA，PDGF-B基因轉(zhuǎn)染可使成纖維細(xì)胞有效而穩(wěn)定的表達(dá)活性PDGF-B而產(chǎn)生生物效應(yīng)。對成纖維細(xì)胞有明顯的促進(jìn)生長作用。
　　 第二部分：血小板衍化生長因子基因活化材料在體實驗研究的組織學(xué)分析
　　 目的：利用光鏡和透射電鏡等組織形態(tài)學(xué)觀察手段，比較實驗組與對照組在重建愈合過程中膠原表達(dá)情況和重建細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的差異，以評價脂質(zhì)體與攜帶血小板衍化生長因子基因片段的合成質(zhì)粒共同構(gòu)成的基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)在兔

4、前交叉韌帶重建動物模型中對移植物愈合的促進(jìn)作用。
　　 方法：成年新西蘭兔48只，隨機分為實驗組和對照組。取半腱肌肌腱替代前交叉韌帶制備重建動物模型，實驗組在重建部位給予基因轉(zhuǎn)染材料，對照組給予鹽水。術(shù)后1個月，3個月和6個月，取出重建前交叉韌帶標(biāo)本，對其進(jìn)行光學(xué)顯微鏡和電鏡觀察，比較膠原表達(dá)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 結(jié)果：光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在不同時期，實驗組的成纖維細(xì)胞數(shù)量、膠原含量、膠原纖維的直徑以及膠原纖維的排列

5、均好于對照組，實驗組標(biāo)本組織形態(tài)在6月時已十分接近正常前交叉韌帶組織結(jié)構(gòu)。電鏡觀察見各時期實驗組的細(xì)胞增生現(xiàn)象比對照組活躍，提示修復(fù)細(xì)胞代謝更旺盛，纖維間隙內(nèi)有較多基質(zhì)成分，胞質(zhì)中可見較為豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和線粒體。
　　 結(jié)論：PDGF生長因子基因轉(zhuǎn)染的重建韌帶組織結(jié)構(gòu)愈合好于對照組，提示以脂質(zhì)體為載體攜帶PDGF-B基因的質(zhì)粒在重建前交叉韌帶愈合局部具有良好的原位轉(zhuǎn)染生物學(xué)效能。具有一定的實際應(yīng)用前景。
　　 第三部分

6、血小板衍化生長因子基因活化材料在體實驗生物力學(xué)測試
　　 目的：觀察脂質(zhì)體-PDGF-B基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)對兔半腱肌肌腱替代前交叉韌帶動物模型中重建韌帶愈合強度的促進(jìn)作用。
　　 方法：成年新西蘭兔48只，隨機分為實驗組和對照組。取半腱肌肌腱替代前交叉韌帶制備重建動物模型，實驗組在重建部位給予基因轉(zhuǎn)染材料，對照組給予鹽水。術(shù)后1個月，3個月和6個月，取出重建前交叉韌帶標(biāo)本，對其作生物力學(xué)測試，記錄最大斷裂負(fù)荷(極限負(fù)荷)、斷裂

7、時最大拉伸位移，應(yīng)力、應(yīng)變及剛度，并作出以上數(shù)據(jù)隨時間變化的關(guān)系圖譜。
　　 結(jié)果：
　　 1.實驗標(biāo)本大體觀察無異常，對照組重建韌帶斷裂1例，實驗組未發(fā)現(xiàn)重建韌帶斷裂，動物模型重建手術(shù)總體成功率為97.9％。
　　 2.術(shù)后1個月時，兩組標(biāo)本的各項力學(xué)指標(biāo)無顯著性差異。術(shù)后第3月和第6月時，實驗組重建韌帶的最大斷裂負(fù)荷和彈性模量兩項性能顯著大于對照組，p≤0.05，但兩組的其它力學(xué)指標(biāo)無顯著性差異。