CpG寡核苷酸和霍亂毒素聯(lián)合STAg滴鼻免疫小鼠誘導的弓形蟲特異性免疫應答.pdf

1、目的：確定CpG寡核苷酸(CpGoligonucleotide，CpGODN)作為可溶性速殖子抗原(solubletachyzoiteantigen，STAg)的最佳劑量，觀察最佳劑量的CpGODN和STAg鼻內免疫小鼠所誘導的免疫應答的持續(xù)時間，以及CpGODN和霍亂毒素(choleratoxin，CT)聯(lián)合佐劑的協(xié)同作用，弓形蟲復合黏膜疫苗研制提供理論和實驗依據。 方法：第一部分：5～6周齡BALB/c小鼠50只隨機分為5組

2、，每組10只，實驗組以0、1、5、10μg的CpGODN聯(lián)合20μgSTAg滴鼻免疫小鼠，對照組以PBS滴鼻，間隔2周免疫2次。末次免疫后30d處死全部小鼠，觀察脾、Peyer’spatch(PP)、腸系膜淋巴結(MLN)和IEL淋巴細胞增殖情況。檢測血清IgG和糞便IgA含量。 第二部分：雌性BALB/c小鼠72只隨機分為實驗組和對照組，每組36只。實驗組以10μgCpGODN聯(lián)合20μgSTAg滴鼻免疫，對照組以PBS滴鼻。

3、間隔2周免疫2次，于末次免疫后第1、2、3、4、5、6周分別隨機處死小鼠(6只/組)。測定小腸沖洗液、鼻咽沖洗液、肺沖洗液、陰道沖洗液IgA和血清IgG。分離脾和IEL進行淋巴細胞計數。 第三部分：5～6周齡BALB/c小鼠30只，雌雄各半，隨機分為4個實驗組和PBS對照組。實驗組分別用20μgSTAg、20μgSTAg+10μgCpGODN、20μgSTAg+1μgCT、20μgSTAg+1μgCT+10μgCpGODN滴鼻免

4、疫，間隔2周免疫2次。對照組用PBS以相同程序免疫。末次免疫后第20d處死小鼠。收集血清和腸沖洗液，用ELISA法檢測血清弓形蟲特異性IgG和腸液IgA含量。分離脾淋巴細胞，用MTT法檢測淋巴細胞增殖活性。 結果：不同劑量的CpGODN聯(lián)合STAg滴鼻免疫小鼠后，10μgCpGODN組小鼠腸相關淋巴組織PP、MLN和IEL以及脾淋巴細胞增殖明顯(P＜0.05)。10μg組血清IgG遠高于對照組(P＜0.05)，糞便IgA高于對照

5、組(P＞0.05)。 10μgCpGODN聯(lián)合STAg滴鼻免疫小鼠后脾淋巴細胞和IEL增生明顯。脾淋巴細胞在第2、3、4、5周顯著高于對照組(P＜0.001)。IEL數量分別在第2、4周出現兩個峰值，第2、3、4周顯著高于對照組(P＜0.001)。實驗組小鼠各沖洗液中IgA平均水平高于對照組。小腸沖洗液中弓形蟲特異性IgA抗體水平在各個時間點均高于對照組。與對照組相比，第2、3周(P＜0.001)，4周(P＜0.05)有顯著差異

6、。鼻咽沖洗液中IgA水平在第1周時最高，各時間點雖高于對照組，但無統(tǒng)計學意義。肺沖洗液IgA在第5周達到高峰，第4、5、6周高于對照組(P＜0.001)。陰道沖洗液IgA在免疫后第1～6周顯著高于對照組(P＜0.01)，第5周時水平最高。實驗組小鼠血清IgG在第1周即顯著高于對照組(P＜0.001)，在之后的4周內呈持續(xù)增高趨勢，至第6周出現下降。 STAg聯(lián)合CpGODN和/或CT滴鼻免疫小鼠后的血清IgGOD值、小腸沖洗液中

7、IgA以及脾淋巴細胞的體外特異性刺激指數(SI)較PBS對照組顯著增加(P＜0.01)。加CpGODN和CT佐劑的實驗組小腸沖洗液中IgA和脾淋巴細胞的SI顯著高于加CpGODN佐劑的實驗組(P＜0.05)。 結論：CpGODN可作為STAg的黏膜佐劑，10μgCpGODN與STAg聯(lián)合具有最佳的免疫效果。STAg/10μgCpGODN滴鼻免疫BALB/c小鼠可誘導產生小腸沖洗液、鼻咽沖洗液、肺沖洗液、陰道沖洗液特異性IgA及血