大鼠三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核內(nèi)Cdk5-p39的表達與活性.pdf

1、周期依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5,Cdk5)是Cdks家族成員之一,屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族,由于Cdk5具有與其他Cdk成員同源序列而得名。其最早從哺乳動物腦中精制出來,并確定了很多特性。Cdk5單體形式?jīng)]有激酶活性,只有與調(diào)節(jié)因子蛋白p35或p39結(jié)合才表現(xiàn)酶活性,p39和p35是Cdk5不可缺少的激活劑。在大鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育時期,p39和p35表現(xiàn)出不同的特點。在時間上,p39的表達總要比p

2、35的表達遲一到二周；在空間上,p39主要表達于小腦,而p35主要表達在海馬和初級嗅皮質(zhì)。在神經(jīng)元亞細胞結(jié)構(gòu)上,p39表達于神經(jīng)元的細胞體和軸突,而p35只表達神經(jīng)元的細胞體,p35和p39在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達差別,提示p35和p39具有不同的作用機理。
　　 p39和p35的時空表達特點對于Cdk5/p35和Cdk5/p39調(diào)節(jié)神經(jīng)元正常生長分化,遷移以及突觸的形態(tài)和功能的整塑等具有不同的作用特點。當神經(jīng)元開始極化時,Cdk5改

3、變其亞細胞定位從細胞體到軸突,p35只表達神經(jīng)元的細胞體,Cdk5/p35對于神經(jīng)元的生長分化有著重要作用,而p39表達于神經(jīng)元的軸突,表明Cdk5/p39對于晚期神經(jīng)元軸突的生長分化有著重要的意義。樹突棘是突觸的重要結(jié)構(gòu),p35、p39均缺乏或Cdk5缺乏的海馬神經(jīng)元樹突棘形態(tài)發(fā)育不全并且密度大大減少,而在p35缺乏的海馬神經(jīng)元,樹突棘的發(fā)育形態(tài)正常而樹突棘的突觸活動能力明顯減弱,表明了樹突棘引起的突觸活動主要依賴于Cdk5/p35的

4、活性。在調(diào)節(jié)突觸囊泡的分泌作用上,Cdk5/p35主要通過和神經(jīng)突觸前膜胞內(nèi)蛋白-18(Munc-18)結(jié)合,并且磷酸化Munc-18,阻止Munc-18和突觸融合蛋白1A(syntaxin 1A)的結(jié)合,促進囊泡的分泌,而Cdk5/p39主要通過磷酸化Munc-18促使囊泡外Ca離子內(nèi)流,從而促進囊泡分泌。Cdk5/p35和Cdk5/p39的上述差別,表明了它們在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育中有著不同作用。此外,Cdk5/p39相對于Cdk

5、5/p35穩(wěn)定性較弱,Triton X-100洗滌劑便可以將純化的Cdk5/p39失活,而Cdk5/p35則不會。Cdk5/p39的復合物活性調(diào)節(jié)主要是依賴于Cdk5蛋白和p39蛋白的結(jié)合和解離,而Cdk5/p35的活性調(diào)節(jié)主要是依賴于p35蛋白的降解和合成。
　　 三叉神經(jīng)痛(Trigeminal neuralgia,TN)是一種以慢性、陣發(fā)性的面部疼痛為特征的疾病,TN的發(fā)病機制仍不甚明了。三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核(Spina

6、ltrigemihal caudal subnucleus,Vc)是外周傷害性信息向中樞傳人的門戶,是接受面口部傷害性刺激信息并將此信息向中樞傳導的中繼站。Vc內(nèi)含有多種傳遞疼痛神經(jīng)肽的陽性纖維末端,它們大部分來源于三叉神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細胞,并且與Vc淺層內(nèi)分布著大量的神經(jīng)元的胞體和突起形成突觸聯(lián)系。
　　 近年來,我們和其他學者研究了Cdk5/p35對神經(jīng)疼痛信號傳遞的調(diào)節(jié)作用。2006年,有學者用p35基因敲除模型p35-/-

7、小鼠及p35過表達模型Tgp35小鼠,以野生型WT小鼠對照,發(fā)現(xiàn)Cdk5活性明顯下降的p35-/-小鼠,對熱刺激引起的疼痛反應也明顯延遲；Cdk5水平明顯上調(diào)的Tgp35小鼠,對熱刺激引起的疼痛出現(xiàn)過敏反應。表明了Cdk5/p35參與了疼痛傳遞的調(diào)節(jié)作用。抑制Cdk5的活性已經(jīng)成為治療急、慢性疼痛的新靶點。
　　 綜合以上研究背景,在本實驗中檢測了出生后大鼠各發(fā)育階段Vc組織中p39和Cdk5的表達變化,并且檢測了Cdk5/p3

8、9活性,通過本次實驗結(jié)果和以往報道的出生后大鼠各發(fā)育階段Vc組織中p35和Cdk5表達變化及Cdk5/p35活性進行了比較分析。
　　 目的：
　　 檢測出生后大鼠各發(fā)育階段Vc組織中p39和Cdk5的表達及Cdk5的活性變化,通過實驗結(jié)果分析比較不同發(fā)育期大鼠Vc內(nèi)Cdk5的活性；分析比較p35和p39在空間和時間上的表達特點,為今后進一步研究在三叉神經(jīng)痛模型中,Cdk5/p35或Cdk5/p39的表達變化及其意義打下

9、良好的實驗基礎(chǔ),以最終闡明三叉神經(jīng)痛的發(fā)病機理為最終目的。
　　 材料與方法：
　　 1.實驗動物分組
　　 SD雄性大鼠108只按發(fā)育階段分為新生,一周,二周,三周,四周,成體各18只,每個發(fā)育階段隨機選取6只做Cdk5的Western bloting檢測、6只做p39的Western bloting檢測和6只大鼠做Cdk5免疫沉淀和蛋白活性分析,所有大鼠均由南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院動物實驗室以常規(guī)固體飼料飼養(yǎng),自

10、由飲水,濕度40％-50％。
　　 2.標本制備
　　 根據(jù)分組標志分別稱取大鼠體重,按3ml/Kg體重腹腔注射水合氯醛麻醉后,根據(jù)Paxinos和Watson的大鼠腦立體定位圖譜定好Vc坐標位置切取大鼠Vc組織塊,分別放入相應標記好的試管,放入-80℃冰箱凍存。
　　 3.Vc組織抗原蛋白的提取
　　 按標記試管取出組織塊,將其放入勻漿器內(nèi),加入細胞裂解緩沖液后,將勻漿器置于冰上進行徹底勻漿后,將勻漿液

11、移至離心管后,在4℃下,12000rpm離心5min,提取其上清液裝于已經(jīng)標志好的離心管中,放入-20℃冰箱保存
　　 4.Vc組織上清液蛋白含量的測定。
　　 5.根據(jù)測定的蛋白含量加樣做Cdk5的Western bloting檢測。
　　 6.根據(jù)測定的蛋白含量加樣做p39的Western bloting檢測。
　　 7.根據(jù)測定的蛋白含量加樣做Cdk5的免疫沉淀和酶活性分析。
　　 結(jié)果：<

12、br>　　 1.Western blot檢測Cdk5和p39蛋白的表達
　　 在大鼠出生后各發(fā)育階段Vc組織中,p39表達變化顯著,p39在新生大鼠的表達較弱,到一周后有所增加,三周時表達最高,這種水平持續(xù)到四周齡,在成體大鼠,p39的表達水平下降到與新生時的表達水平基本相當,而Cdk5的表達在整個發(fā)育階段無明顯的變化。
　　 2.Cdk5蛋白的免疫沉淀和酶活性分析的統(tǒng)計分析
　　 在大鼠出生后各發(fā)育階段的Vc

13、組織中,Cdk5活性呈現(xiàn)遞減的曲線,在新生的大鼠Vc組織中,Cdk5的表達活性最高,從出生后的一周、二周、三周、到四周逐漸遞減,在成體大鼠,Cdk5的活性最低。新生大鼠的Cdk5活性約是成體的六倍。
　　 結(jié)論：
　　 (1)在大鼠出生后各發(fā)育階段Vc組織中,Cdk5的表達和Cdk5的活性變化無顯著關(guān)系；
　　 (2)在大鼠出生后各發(fā)育階段Vc組織中,p35和p39的表達有顯著差異。p35表達在新出生、一周、二周