外源香蕉枯萎病菌基因小分子RNA對其生長發(fā)育的影響.pdf

1、香蕉枯萎病危害著我國和世界香蕉產業(yè)的健康發(fā)展，是亟待解決的世界性難題。寄主植物誘導基因沉默技術是培育廣譜和持久抗病性的香蕉新種質的有效途徑之一。前期通過對香蕉枯萎病菌早期發(fā)育蛋白質組和24種營養(yǎng)親和型病原菌基因組的深入分析，發(fā)現麥角甾醇生物合成途徑FoERG6、FoERG11、FoERG13和FoERG25蛋白對病原菌的生長發(fā)育至關重要，是極佳的防控靶標位點。其中FoERG6蛋白有兩個同源基因編碼即FoERG6A、FoERG6B，FoE

2、RG11蛋白有三個同源基因編碼即FoERG11A、FoERG11B、FoERG11C，FoERG13蛋白有三個同源基因編碼即FoERG13A、FoERG13B、FoERG13C，FoERG25蛋白有三個同源基因編碼即 FoERG25A、FoERG25B、FoERG25C。本研究主要通過從體外外飼靶標基因小分子RNA處理香蕉枯萎病菌熱帶四號生理小種（Foc TR4）和一號生理小種（Foc Race1），探索其抑菌效果及相關分子機理，為香蕉

3、抗病分子育種提供理論依據。獲得如下結果：
　　1.成功構建了分別表達 Foc TR4 ERG6、ERG11、ERG13和 ERG25雙鏈 RNA（dsRNA）的原核表達載體和香蕉遺傳轉化表達載體
　　均以“正向片段+內含子+反向片段的”的形式,將四個靶標基因的特異干涉片段構建了由prrn強啟動子驅動、能在大腸桿菌HT115（RNaseIII缺失體）中表達完整dsRNA的載體DI-T-P中；以及由Ubi強啟動子驅動，適合在香蕉

4、中表達dsRNA的載體pYL-RNAi中。通過定量PCR檢測了陽性菌株中上述基因dsRNA的表達量；通過寄主植物誘導基因沉默技術，獲得了含有 FoERG6和 FoERG11干涉片段的轉基因香蕉植株（由博士生竇同心完成）。
　　2．四個靶標蛋白編碼基因的dsRNA對Foc TR4和Foc Race1病原菌的早期發(fā)育都有顯著的抑制效果
　　提取含靶標基因dsRNA的陽性菌株總RNA，在體外對Foc TR4和Foc Race1進行

5、外飼處理，加入總RNA的濃度為500 ug/ul，孢子處理濃度為1×105conidia/ml，分別在12、24和48小時時間點取樣觀察，發(fā)現四個靶標基因的dsRNA對Foc TR4和 Foc Race1早期發(fā)育均表現出顯著的抑制作用，其中 FoERG11和 FoERG25 dsRNA的抑菌作用優(yōu)于FoERG6和FoERG13,并說明靶標蛋白編碼基因序列在香蕉枯萎病菌中高度保守。
　　3.經靶標基因dsRNA處理后Foc TR4中

6、相應的靶標基因、麥角甾醇和膽固醇生物合成途徑相關基因的表達譜變化
　　Foc TR4經靶標基因dsRNA處理0和12小時后，運用定量PCR對靶標基因、麥角甾醇和膽固醇生物合成途徑相關基因的表達量進行了分析。發(fā)現自身基因都顯著下調，其他麥角甾醇途徑中的基因即ERG3A、ERG3B、ERG4、ERG6A、ERG6B、ERG11A、ERG11B、ERG11C、ERG13、ERG11A、ERG11B、ERG11C和ERG25均顯著下調表達

7、，膽固醇合成途徑中的基因即TGL、ARE1A和ARE1B均顯著上調表達。說明外飼靶標蛋白編碼基因的dsRNA，都能有效抑制四個蛋白編碼的靶標基因的表達，同時也影響到了麥角甾醇生物合成途徑中其它基因和膽固醇合成途徑相關基因的表達。
　　4.高通量測序分析轉基因香蕉植株中小分子RNA的表達
　　課題組其他成員運用寄主植物誘導基因沉默技術，就是讓香蕉表達 dsRNA來沉默入侵病菌細胞內的靶標基因，以達到干擾病菌麥角甾醇生物合成、破

8、壞其生物膜功能的目的。首先獲得了對香蕉枯萎病有一定廣譜抗性的新種質 RNAi-FoERG6和 RNAi-FoERG11。本研究選擇野生型和四個不同轉基因株系（RNAi-ERG6-8、RNAi-ERG6-36、RNAi-ERG11-43、RNAi-ERG11-52）進行小分子 RNA測序分析，靶標基因小分子 RNA（siRNAs）的表達量占香蕉總量的1.96％、2.02%、5.47%和6.20%。此外，外飼含靶標基因siRNA的轉基因香蕉

9、汁液，也能有效抑制Foc TR4的早期發(fā)育。說明在轉基因香蕉異源表達枯萎病菌Foc TR4FoERG6和FoERG11基因的siRNAs能顯著提高它們的抗病性。
　　綜上所述，本研究證明Foc TR4的ERGs基因序列在香蕉枯萎病菌小種間非常保守；Foc TR4能夠吸收外飼的完整dsRNA和siRNA，并引發(fā)體內的RNAi沉默機制；再次說明抑制香蕉枯萎病菌麥角甾醇生物合成途徑，干擾其生物膜功能，能有效抑制病原菌的生長。由于ERGs