水稻白葉枯病菌中趨化性基因che的表達調(diào)控及其功能研究.pdf

1、環(huán)鳥苷二磷酸(c-di-GMP)是一種參與細菌信號轉導的小分子第二信使，調(diào)控了生物膜、胞外多糖形成、運動性、毒性等許多生理功能。水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)全局性轉錄調(diào)控因子Clpxoo作為一種重要的受體蛋白，其cNMP結構域可與c-di-GMP結合、并發(fā)生蛋白構象的改變，而其 DNA結合結構域與下游靶基因啟動子相結合、調(diào)控基因的表達。Clpxoo介導的c-di-GMP信號調(diào)控機

2、制參與Xoo多種重要的生理生化過程，對毒性表達起著非常重要的作用。本研究選取了受Clpxoo蛋白正調(diào)控的趨化性基因che(PXO_00043)為靶基因，深入探索che基因表達的調(diào)控機制及其在Xoo毒性中的功能。取得以下主要研究結果：
　　1.利用5’RACE(rapid-amplification of cDNA ends)法，鑒定了che基因轉錄啟始位點，利用含有GFP報告基因的pPROBE-AT載體，構建了che基因啟動子活性

3、檢測系統(tǒng)，通過熒光顯微鏡和流式細胞儀的檢測，明確了che基因啟動子的活性，發(fā)現(xiàn)Clpxoo蛋白是激活che基因所必需的。此外，雖然che基因在XOM2培養(yǎng)基中上調(diào)表達，但并不顯著受轉錄調(diào)控蛋白HrpX和HrpG的影響。
　　2.分別構建了Clpxoo蛋白第70位天冬氨酸位點D70、第99位谷氨酸E99和第166位精氨酸R166位點的點突變，并進行了表達和純化。利用結合等溫滴定實驗(ITC)，檢測了點突變體與c-di-GMP的結合能

4、力。發(fā)現(xiàn)R166突變成丙氨酸R166A后，蛋白發(fā)生嚴重降解和穩(wěn)定性降低的現(xiàn)象；D70突變成丙氨酸D70A后，點突變體完全喪失了與c-di-GMP結合的能力；E99突變成絲氨酸E99S后，點突變體與c-di-GMP結合能力大大減弱。因此，Clpxoo蛋白D70和E99是與c-di-GMP結合的關鍵氨基酸位點。
　　3.構建了受Clpxoo蛋白調(diào)控的趨化性基因che的缺失突變體及其互補菌株，檢測了它們對水稻的致病表型。發(fā)現(xiàn)che基因缺