多組學研究揭示根腫菌生長發(fā)育與致病的分子機理.pdf

1、蕓薹屬根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）是有孔蟲界專性活體寄生植物病原原生動物，由其引起的根腫病是十字花科蔬菜和經(jīng)濟作物上的重要病害，每年造成了重大的經(jīng)濟損失。國際上對根腫菌e3和Pb3菌株進行了全基因組序列分析，為深入研究根腫菌生長、發(fā)育及其致病機制提供新的契機?？紤]到根腫菌豐富的致病型，不同致病型或不同地域的菌株之間在基因組上可能會存在差異，本研究對分離自我國湖北省枝江市罹病油菜植株的根腫菌單孢

2、分離菌株ZJ-1菌株（1號致病型）進行了全基因測序分析，并與e3和Pb3菌株的基因組進行了比較，綜合基因組學和轉(zhuǎn)錄組學，對根腫菌的分類地位、休眠、生長和發(fā)育及其致病分子機理進行了系統(tǒng)的分析，并對生長、發(fā)育相關(guān)的重要信號通路和致病因子等進行了試驗驗證，取得的主要研究結(jié)果如下:
　　對根腫菌ZJ-1菌株進行了基因組de novo測序，獲得的基因組大小為24.1 M，contig N50和scaffold N50分別為73.856kb和

3、510.27 kb。CEGMA評價表明獲得的基因組序列完整性和連續(xù)性好，相近或稍優(yōu)于e3和Pb3的基因組。ZJ-1菌株的基因組大小與e3菌株(24 M)和Pb3菌株(24.2 M)基因組大小相近，但是ZJ-1菌株基因組共預測到10，951個具有蛋白編碼功能的基因，分別比e3和Pb3菌株多出1，221個和881個。ZJ-1菌株與e3菌株的基因組共線性高，共有104個LCBs（局部共線性塊），但也呈現(xiàn)明顯的基因組片段重排（異位、倒置）現(xiàn)象;

4、全基因組點圖比較表明這兩個基因組也存在明顯的差異。
　　根腫菌ZJ-1菌株基因組重復序列的總長度達為495，571 bp，占全基因組的2.01％，重復序列比例低、基因密度高，達到454.40個基因/Mb。在已測序的有孔蟲界及SAR超群物種中，根腫菌的基因組最小。將根腫菌與18種已測序的在進化節(jié)點上具代表性的物種進行系統(tǒng)進化比較，發(fā)現(xiàn)原生生物界的阿米巴蟲和囊泡藻與真菌界、植物界和動物界聚為一支，而包括根腫菌在內(nèi)的有孔蟲界物種成為真核

5、生物進化樹中獨立的一支，表明以根腫菌為代表的有孔蟲界物種在真核生物進化史中的獨特進化地位。
　　從ZJ-1菌株看，根腫菌物種獨有的基因家族基因共4，197個;117基因家族，共計611個基因顯著擴張。對這些基因的GO功能富集分析表明其功能主要富集于GPCR信號轉(zhuǎn)導途徑、幾丁質(zhì)生物合成過程和DNA整合等生物學過程等。推定這些過程對根腫菌發(fā)育至關(guān)重要。通過GPCR抑制劑處理，抑制根腫菌GPCR相關(guān)通路，可以延緩根腫菌的發(fā)育進程，顯著緩

6、解根系腫大癥狀，進一步證實GPCR信號轉(zhuǎn)導相關(guān)通路在根腫菌生長發(fā)育和致病過程中具有重要的作用。
　　從多組學角度對處于休眠孢子階段、休眠孢子萌發(fā)階段、次生原質(zhì)團發(fā)育階段三個不同生長發(fā)育狀態(tài)的根腫菌進行了RNA-Seq測序分析，對這三個狀態(tài)下的基因調(diào)控分子機理進行深入解析。發(fā)現(xiàn)在甾體降解代謝、類黃酮生物合成、α-亞麻酸代謝、甘油磷脂代謝和醚脂類代謝途徑等在根腫菌休眠孢子中比較活躍，推定它們與根腫菌維持休眠狀態(tài)緊密相關(guān);在休眠孢子萌發(fā)

7、階段，病菌可能需要激活更多碳水化合物代謝通路。次生原質(zhì)團發(fā)育階段的基因表達調(diào)控模式不同于另外兩個階段，該階段有458個基因顯著上調(diào)表達，它們參與細胞分裂、生長、DNA復制和蛋白翻譯等過程相關(guān)。在休眠孢子萌發(fā)階段和次生原質(zhì)團發(fā)育階段中含錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域、含P環(huán)三磷酸核菅水解酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶等等基因的表達量均很高。
　　休眠孢子對于根腫菌的存活和傳播十分重要，休眠孢子中脂滴的成分與孢子的存活是否相關(guān)并不清楚。從多組學角度分析

8、了在根腫菌中的脂滴及其相關(guān)的代謝途徑。利用蛋白質(zhì)組學分析手段從根腫菌休眠孢子脂滴中鑒定出295個脂滴結(jié)合蛋白，從基因組中鑒定出167個參與脂代謝相關(guān)通路的基因，脂肪酸合成途徑相關(guān)的基因在次生原質(zhì)團發(fā)育階段表達水平高;在休眠孢子階段，花生四烯酸代謝途徑、醚脂類代謝、酮體合成和降解途徑的基因具有較高表達量。根腫菌富含甘油三脂，Z J-1菌株基因組中包含有完整的甘油三酯合成、儲存和降解通路?；虮磉_動態(tài)的聚類分析表明處于休眠孢子萌發(fā)階段的根腫

9、菌通過甘油三酯和脂肪酸降解過程，利用脂滴中的貯存的能量;休眠孢子中大部分(76.6％)的脂肪酸屬于飽和脂肪酸（C16∶0和C18∶0），不飽和脂肪酸中花生四烯酸C20∶4含量最高，占整個不飽和脂肪酸含量50％左右。
　　根腫菌是植物細胞內(nèi)的活體寄生菌，這種寄生方法在植物真核病原物中非常獨特，一方面需要維系寄主細胞的活力，同時也需要成功抑制寄主的防御反應。我們對這種專性活體寄生生活方式從比較基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和分泌組學角度進行了解析

10、。發(fā)現(xiàn)許多參與初級代謝過程的基因，在根腫菌進化過程中丟失;根腫菌基因組中CAZymes相關(guān)基因和次級代謝基因減少，體現(xiàn)其極端的活體寄生策略;編碼ABC轉(zhuǎn)運體的基因在基因組中顯著擴張且相關(guān)基因在次生原質(zhì)團發(fā)育階段具有較高表達水平。ZJ-1菌株中至少有4個有參與調(diào)控寄主植物激素水平的基因，其中PBHK1和PBHK2在ZJ-1和e3菌株中均存在，推定它們編碼的蛋白參與了寄主植物激素的調(diào)節(jié)過程。從ZJ-1菌株基因組中預測到739個編碼分泌蛋白的

11、基因，其中111個基因在休眠孢子萌發(fā)階段或次生原質(zhì)團生長階段具有較高的表達水平。最后篩選出20個候選效應子蛋白，其中8個為ZJ-1菌株特有。選取其中6個候選效應子蛋白進行進一步驗證，發(fā)現(xiàn)它們均可分泌到胞外;在本氏煙草上測定結(jié)果表明效應子蛋白EC4(PlasB_07397)能誘導煙草葉片產(chǎn)生嚴重壞死癥狀，且其質(zhì)外體定位對于其引起煙草葉片的壞死反應至關(guān)重要;效應子蛋白EC1(PlasB_06695)能夠抑制由促凋亡蛋白Bax誘導的煙草葉片壞

12、死反應。這些特性均揭示了根腫菌專性活體寄生的獨特方式。
　　根腫菌次級游動孢子進入寄主皮層細胞后，發(fā)育成次生原質(zhì)團。原質(zhì)團的細胞核不斷分裂，其體積也不斷增大，最終原質(zhì)團割裂，形成成熟的休眠孢子充滿寄主細胞。次生原質(zhì)團發(fā)育階段差異表達的基因，其KEGG途徑功能主要富集于“翻譯”、“細胞生長與死亡”、“細胞通訊”和“癌癥”四個方面。以此為線索，從ZJ-1菌株全基因組中鑒定出171個能夠注釋到與癌癥相關(guān)途徑的基因，其中原癌基因Pb-Ra

13、f1、Pb-Raf2和Pb-MYB編碼的蛋白分別與人類原癌基因Raf、MYB同源，且它們在次生原質(zhì)團發(fā)育階段被顯著激活;鑒定出三個與癌癥信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的通路（Ras/Raf/MEKfERK信號通路、PI3K/Akt信號通路、mTOR信號通路），在多核次生原質(zhì)團發(fā)育階段，信號轉(zhuǎn)導通路中的12個核心基因也具有顯著上調(diào)表達趨勢。利用PI3K抑制劑抑制根腫菌的PI3K/Akt信號通路后發(fā)現(xiàn)次生原質(zhì)團發(fā)育進程顯著受阻，緩解了油菜的根腫癥狀。進一步表