硫化氫預處理骨髓間充質干細胞治療大鼠急性心肌梗死的實驗研究.pdf

1、急性心肌梗死(AMI)及其引起的心力衰竭是目前世界范圍內危害人類健康的重要疾病，近20余年來以干細胞治療為代表的心肌再生醫(yī)學成為動物實驗和臨床研究的熱點，干細胞療法已成為治療AMI最有前途的方法之一，但多項臨床研究均提示骨髓干細胞治療對AMI后心功能的改善非常有限。移植后干細胞存活率低下是制約干細胞治療效果的重要因素。有研究表明移植4天后局部干細胞的存活率僅為0.44％，隨著時間的進一步延長，干細胞在心肌局部的存活率繼續(xù)顯著降低?；谶@

2、些研究發(fā)現(xiàn)我們有理由相信提高干細胞的存活率無疑可顯著提高干細胞的治療效果。
　　 硫化氫是繼一氧化氮、一氧化碳后發(fā)現(xiàn)的存在于人體內的第三類氣體信號分子。其參與體內多個生理過程包括細胞保護、血管新生、血管擴張及抗動脈粥樣硬化作用。雖然其細胞保護作用在多種細胞中發(fā)現(xiàn)，但目前尚無硫化氫與干細胞相互作用的相關研究。
　　 本文著眼于提高干細胞存活率這一影響干細胞治療效果的重要因素，從硫化氫對骨髓間充質干細胞的可能作用入手，分為體

3、內、體外兩個主要部分探討了硫化氫對骨髓間充質干細胞的保護作用及其機制。
　　 本實驗主要分為以下三個部分：
　　 第一部分、大鼠骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)及純化
　　 目的：分離培養(yǎng)符合實驗要求的大鼠骨髓間充質干細胞并進行鑒定，為此后進一步的實驗研究奠定基礎。
　　 方法：全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞并傳代培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)及生長過程。以流式細胞儀鑒定其表面抗原，并檢測體外標準誘導條件下該類

4、細胞向脂肪細胞分化的能力。
　　 結果：原代細胞呈梭形或不規(guī)則形，貼壁集落生長。體外傳代培養(yǎng)2代后細胞呈較均一性成纖維樣，均勻生長。流式細胞儀檢測細胞表面抗原，結果表明培養(yǎng)細胞強表達干細胞標記CD90，而少表達造血干細胞抗原CD34。標準成脂誘導條件下，油紅染色證實其可向脂肪細胞分化。
　　 結論：全骨髓貼壁培養(yǎng)法可獲取較高純度的大鼠間充質干細胞，滿足體內外實驗要求。
　　 第二部分、硫化氫對缺氧誘導大鼠骨髓間充

5、質干細胞凋亡的保護作用及機制研究
　　 目的：證實硫化氫預處理對缺氧誘導間充質干細胞凋亡的潛在保護作用，并初步探討其機制。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)、擴增大鼠骨髓間充質干細胞：建立體外缺氧誘導細胞凋亡模型；給予或不給予細胞硫化氫預處理，缺氧誘導后流式細胞儀及熒光顯微鏡檢測細胞凋亡，臺盼藍染色及CCK-8法檢測細胞活力；熒光顯微鏡檢測細胞內活性氧水平；Western blot檢測pAkt、pErk1/2、peNOS、pFo

6、x01、pGSK-3β、Fox01、Akt、Erk1/2、Pim-1、Bcl-2及Bax的表達變化。劃痕實驗評價硫化氫預處理對間充質干細胞遷移作用的影響。ELISA法檢測培養(yǎng)液上清VEGF水平評價硫化氫預處理對干細胞旁分泌的影響。
　　 結果：無糖、無血清培養(yǎng)條件下缺氧6小時可成功誘導間充質干細胞凋亡；10～300μ mol/L硫化氫預處理30分鐘可濃度依賴性減少缺氧誘導的細胞凋亡；此后本實驗采用200μ mol/L硫化氫作為干

7、預濃度；結果提示200μ mol/L硫化氫預處理可明顯減少缺氧條件下細胞凋亡，流式檢測細胞凋亡率由25.45％降至14.09％(P<0.05)，200μ mol/L硫化氫預處理可增強細胞活力(臺盼藍染色：67％vs46％，P<0.05；CCK-8:52％vs38％，P<0.05)，此外硫化氫預處理還可明顯減少缺氧誘導的細胞內活性氧水平升高；Western blot表明硫化氫預處理可明顯提高間充質干細胞內Akt，Erk1/2及GSK-3β

8、的磷酸化水平；并且在缺氧培養(yǎng)條件下顯著上調Pinr-1、Bcl-2的蛋白表達，抑制Bax的蛋白表達，提示硫化氫可能通過PI3K/Akt及MEK/Erk1/2/GSK-3β途徑發(fā)揮細胞保護作用。硫化氫預處理對間充質干細胞遷移無明顯影響，而且我們也未觀察到其對于細胞旁分泌作用的影響。
　　 結論：硫化氫預處理可明顯減輕缺氧誘導的間充質干細胞凋亡，增強細胞活力。這種保護作用可能是通過激活PI3K/Akt及MEK/Erk1/2/GSK-

9、3β途徑并減少細胞內活性氧水平實現(xiàn)的。
　　 第三部分、硫化氫預處理骨髓間充質干細胞治療大鼠急性心肌梗死的在體研究
　　 目的：體外實驗中硫化氫預處理可明顯減少缺氧誘導的間充質干細胞凋亡，本部分實驗主要研究硫化氫預處理是否可增強間充質干細胞治療急性心肌梗死的療效。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)、擴增雄性SD大鼠骨髓間充質干細胞。采用結扎前降支的方法建立大鼠急性心肌梗死模型，造模成功后即刻用微量注射器在左室前壁沿梗死邊

10、緣多點注射1×106個細胞/100ul或等量PBS。動物實驗主要分為兩個部分：(1)雌雄不匹配心肌梗死模型在體評價細胞移植后細胞存活率：選擇雌性SD大鼠造模，移植細胞來源于雄性大鼠。造模成功后隨機分為兩組并進行干細胞移植：MSCs組心肌內注射1×106個未經(jīng)硫化氫預處理的干細胞，H2S組心肌內注射1×106個硫化氫預處理的干細胞。4天后取材提取組織DNA，Real-time PCR檢測sry基因評價干細胞存活率。(2)雌雄匹配模型評價細

11、胞移植后心臟功能及左室重構：干細胞來源及造模動物均為雄性大鼠。造模成功后隨機分為三組并進行干細胞移植：PBS組心肌內注射100μ1 PBS；MSCs組心肌內注射1×106個未經(jīng)硫化氫預處理的干細胞，H2S組心肌內注射1×106個硫化氫預處理的干細胞。4周后心超評價左室收縮功能；Tunel法評價心肌細胞凋亡率；Masson染色評價梗死面積及心肌內纖維沉積情況；CD31免疫組織化學染色評價新生血管情況。
　　 結果：4周后心超結果提

12、示H2S組及MSC組心功能明顯優(yōu)于PBS組(LVEF：45.35±2.25％vs36.92±0.79％vs30.29±1.80％)，且H2S組好于MSC組。雖然三組間心肌細胞凋亡無明顯差異。但與PBS組相比，兩組干細胞治療均可減少心梗后梗死面積(30.30±3.37％vs39.78±3.14％vs49.12±2.25％)及心肌內纖維沉積，且H2S組的改善作用更為明顯。免疫組化結果提示與PBS及MSCs組相比，硫化氫預處理后的干細胞治療組