載骨形態(tài)發(fā)生蛋白2功能多肽可注射硫酸鈣-礦化膠原骨修復(fù)材料的研究.pdf

1、第一部分，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2功能多肽的合成及骨誘導(dǎo)活性的初步研究
　　目的:研究骨形態(tài)發(fā)生蛋白2功能多肽的骨誘導(dǎo)活性。
　　方法:FMOC/tBu固相多肽合成法合成P17,取少量樣品做質(zhì)譜分析和色譜分析確定P17分子量和純度。SD大鼠間充質(zhì)細胞體外培養(yǎng),將P17以生理鹽水溶解,并配置10μg/ml和30μg/ml的兩種溶液,添加到大鼠間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)液中。2周和3周時顯微鏡下觀察細胞生長情況及檢測堿性磷酸酶的活性。

2、　　結(jié)果:FMOC/tBu固相多肽合成的P17的平均分子量為2023.67,與理論上設(shè)計多肽的分子量一致;高壓液相色譜儀顯示合成的活性多肽純度為96％,達到實驗的要求。隨著培養(yǎng)時間的延長,各組細胞ALP活性均持續(xù)增高。2周和3周時,30μg/ml組ALP含量均高于10μg/ml。
　　結(jié)論:通過固相多肽合成法合成的P17體外具有誘導(dǎo)活性,濃度30μg/ml組的誘導(dǎo)活性優(yōu)于10μg/ml組。
　　第二部分，載骨形態(tài)發(fā)生蛋白2功

3、能多肽硫酸鈣/礦化膠原骨修復(fù)材料的制備及特征
　　目的:制備α型半水硫酸鈣(α-CSH)和礦化膠原(nHAC)復(fù)合的骨修復(fù)材料,測試其不同組分的理化性質(zhì)、降解性能和力學性能;將α-CSH/nHAC與BMP-2功能多肽P17復(fù)合,測定其體外釋放性能。
　　方法:1.將礦化膠原含量為0%、5%、10%和20%與α-CSH混合,取不同配比的混合材料2g與去離子水按不同液/固比混合均勻成漿體,移至5ml注射器內(nèi),在材料保持良好可注射

4、性的前提下,記錄此時液固比。2.研究不同的液固比、礦化膠原含量、促凝劑的含量與固化性能的關(guān)系。3.不同組份的人工骨固化后,置于萬能材料試驗機,測試材料的力學性能。4.將模具中固化的樣品放入模擬體液中,測試其降解率。5.將模具中固化并負載P17圓柱狀材料放入模擬體液中,測定材料的釋放性能。
　　結(jié)果:(1)礦化膠原的含量與液固比有一定的聯(lián)系,隨著礦物化膠原含量增加,其液固比也需增加,才能良好注射性。(2)隨著礦化膠原含量及液固比的增

5、加,其凝固時間也不斷的增加,促凝劑CSD的加入可大大縮短其凝固時間。根據(jù)組份不同其凝固時間可以調(diào)節(jié)在4.3±0.6分鐘至169±22.3分鐘。(3)隨著液固比的增加和礦化膠原含量的增加,材料的壓縮強度從最高的18.3±2.3兆帕降低為1.5±0.5兆帕。(4)液固比增加,材料的降解速率增加;相同的液固比條件下,礦化膠原含量越多降解速率越慢;促凝劑和功能多肽P17對復(fù)合材料降解速率沒有顯著影響。(5)硫酸鈣/礦化膠原可作為P17的緩釋載體

6、,體外呈持續(xù)性釋放,釋放時間可持續(xù)21天以上。
　　結(jié)論:硫酸鈣/礦化膠原是一種具有原位自固化性能的可注射骨修復(fù)材料,其可作為BMP-2功能多肽P17的載體。
　　第三部分，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2功能多肽/硫酸鈣/礦化膠原修復(fù)骨缺損的實驗研究
　　目的:研究BMP-2功能多肽P17/硫酸鈣/礦化膠原修復(fù)骨缺損的能力。
　　方法:新西蘭白兔45只,雙側(cè)股骨髁部制作腔隙性骨缺損,深度10mm,直徑7mm。動物隨機分為三個組

7、,即空白組(A組)、硫酸鈣/礦化膠原組(B組),P17/硫酸鈣/礦化膠原組(C組)。植入相應(yīng)的材料,術(shù)后對動物進行大體觀察,術(shù)后4、8、12周分批處死動物,進行X線和MicroCT檢測、組織學觀察,比較各組材料修復(fù)骨缺損的能力。
　　結(jié)果:大體觀察:所有動物均在術(shù)后1小時蘇醒,當天可站立,術(shù)后第2天可自由活動。A組一只出現(xiàn)手術(shù)部位骨折,補充一只。其余動物無明顯并發(fā)癥發(fā)生。傷口處無明顯紅腫發(fā)生。膝關(guān)節(jié)活動度尚可。X線觀察:A組:12

8、周時骨缺損依然明顯,骨缺損邊緣模糊,少量新生骨生成。B組:術(shù)后4周可見材料部分降解,仍有部分材料影像,骨缺損邊緣模糊,少量新生骨生成;術(shù)后8周材料幾乎完全降解,缺損區(qū)域仍然可見,但修復(fù)效果明顯優(yōu)于A組;術(shù)后12周骨缺損大部分修復(fù),未見有明顯剩余材料。C組:術(shù)后各時間點修復(fù)效果優(yōu)于其它兩組,12周時骨缺損完全修復(fù),骨缺損處密度均勻。MicroCT檢測:新生骨主要從缺損的邊緣形成,向心生長。其中C組的骨缺損修復(fù)情況明顯好于其他兩組,術(shù)后12

9、周時,A組骨缺損依舊很明顯。組織學觀察:在HE染色中,從4周到12周,A組新生骨面積由6.20±7.6%增加到15.40±7.30%,B組由32.20±6.26%增加到41.60±4.39%,C組由38.00±8.97%增加到67.20±6.89%,與C組相比,A組和B組的面積明顯少于C組,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。在天然猩紅染色中,各個時間點,A組和B組的I型膠原纖維面積明顯少于C組,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。