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文檔簡介
1、目的:糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)最常見的微血管并發(fā)癥之一。也是導(dǎo)致晚期腎功能衰竭的主要病因。目前尚缺乏早期診斷DN的指標(biāo)。脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(A-FABP或FABP4)是FABPs家族的一員,是成熟脂肪細(xì)胞胞質(zhì)的重要蛋白,主要參與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的代謝,可與脂肪酸結(jié)合,增強游離脂肪酸(FFA)的可溶性,促進(jìn)FFA轉(zhuǎn)運。長鏈脂肪酸、胰島素和過氧化物酶增殖因子活性受體γ(PPAR-γ)激動劑可誘導(dǎo)FABP4的表達(dá)。由于長鏈脂肪酸及其
2、代謝產(chǎn)物在信號傳導(dǎo)通路中起一級或二級信號作用,因而FABP4可能以FFA為配體,在轉(zhuǎn)移脂肪酸的同時起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。有研究表明循環(huán)FABP4濃度在代謝綜合征和2型糖尿病等脂質(zhì)代謝紊亂性疾病中明顯升高,認(rèn)為FABP4在上述疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用,并能預(yù)測這些疾病的發(fā)展。
本實驗首先采用免疫組化和Western blot法檢測FABP4在正常Wistar大鼠各組織中的分布、定位和定量。之后,動態(tài)觀察STZ誘發(fā)1型糖尿病大鼠
3、空腹血清FABP4、FFA的改變;進(jìn)而觀察糖尿病腎組織FABP4蛋白含量變化,試圖探討FABP4作為糖尿病腎病早期生物標(biāo)記物的可行性。
方法:
1、正常大鼠FABP4在各組織的分布、定位和含量
正常清潔級Wistar大鼠雌雄各8只。取雌雄各5只大鼠,用4%多聚甲醛行全身灌流固定后,取腦、眼、心、肺、肝、腎、脂肪、骨骼肌、小腸、胰腺、膀胱、卵巢和睪丸組織置于4%多聚甲醛固定,用于HE染色和FABP
4、4免疫組化染色。其余雌雄各3只大鼠處死后,取心、肺、肝、腎、脂肪、骨骼肌、小腸、胰腺、膀胱、卵巢和睪丸組織提取蛋白做FABP4western blot分析。
2、建立1型糖尿病大鼠模型并動態(tài)檢測空腹血清FABP4、FFA、血脂的變化
正常清潔級Wistar大鼠雄性14只,隨機分為對照組(C組)5只和糖尿病組(DM組)9只。左側(cè)單腎切除一周后,以60mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ),制造1型糖尿病大鼠模型
5、。對照組左側(cè)單腎切除一周后腹腔注射同體積枸櫞酸緩沖液。72h后測尾尖靜脈血血糖,血糖≥16.7mmol/L者確定為DM模型制作成功。分別于3天,1,2,4,8,12周收集24小時尿,用Elisa法檢測24h尿白蛋白。1,2,4,8,12周取空腹末梢靜脈血(眼內(nèi)眥靜脈),離心后取血清,-20℃保存。集中統(tǒng)一測定FABP4、FFA、血糖(FBG)、血脂:甘油三酯(TG),總膽固醇(T-CHO)和其他血生化指標(biāo)。
3、檢測糖尿病
6、大鼠腎臟FABP4的表達(dá)和含量變化
正常清潔級Wistar雄性大鼠40只,建立1型糖尿病大鼠模型,方法同2。造模后分別于2,4,8,12周各取10只大鼠(C組4只,DM組6只),取末梢靜脈血離心后取血清測量血糖。其中4只大鼠(對照組1只,病變組3只)行灌流固定后取部分腎組織置于4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋、切片,用于HE、PAS和骨橋蛋白(OPN)、ED1免疫組織化學(xué)染色。其余6只(C組、DM各3只)大鼠稱體重、腎重;取
7、腎組織置于PLP固定液中固定,蔗糖溶液梯度脫水,OCT包埋,行組織冰凍切片,用于檢測腎臟FABP4;取部分腎皮質(zhì)用于提取蛋白做FABP4和OPN western blot分析。
結(jié)果:
1、FABP4在正常大鼠各組織中的表達(dá)
1.1 FABP4免疫組化結(jié)果:(1)所有脂肪細(xì)胞的胞漿和胞核表達(dá)陽性。(2)多數(shù)組織毛細(xì)血管和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿和胞核FABP4表達(dá)陽性,但組織不同,內(nèi)皮細(xì)胞陽性表達(dá)差異
8、較大:脂肪、心肌、骨骼肌、小腸和胰腺均有表達(dá);肺臟、腎臟、肝臟、膀胱、睪丸和卵巢呈區(qū)域性表達(dá);眼和腦未見表達(dá)。(3)巨噬細(xì)胞:只有肺內(nèi)巨噬細(xì)胞和極少數(shù)肝臟枯氏細(xì)胞胞漿和胞核有表達(dá)。(4)其他陽性表達(dá)細(xì)胞:腎盂和膀胱的移行上皮細(xì)胞胞漿胞核、卵巢黃體細(xì)胞胞漿胞核和胰島細(xì)胞胞漿有陽性表達(dá)。
1.2 Western blot定量結(jié)果:心肌、胰腺、脂肪、肺、腎皮質(zhì)、小腸、睪丸、骨骼肌、卵巢、膀胱中均有FABP4的表達(dá)。其中脂肪組織F
9、ABP4含量最多,其次是心肌,腎皮質(zhì)含量較少,肝臟未見條帶。
21型糖尿病大鼠空腹血清FABP4、FFA及血脂的動態(tài)檢測2.1 DM組第1周空腹FABP4即明顯升高,之后各時間點均明顯高于對照組。
2.2 DM組第1周空腹FFA即明顯高于對照組,并持續(xù)到第12周。
2.3 FBG、空腹血脂變化:DM組除第2周T-CHO與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異外,其余FBG、TG、T-CHO、尿素氮(BUN)在1、2
10、、4、8、12周均高于對照組。
2.4 DM組從3天起,24h尿白蛋白即高于對照組,這種趨勢一直持續(xù)到第8周。
2.5 DM組雖然血清白蛋白(ALB)在各時間點均低于C組,但只有8周和12周差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.6相關(guān)分析結(jié)果:Spearman's相關(guān)分析顯示:空腹FABP4與FFA(r=0.512,p=0.000)、FBG(r=0.434,p=0.003)、TG(r=0.360,p=0.01
11、7)、24h尿白蛋白(r=0.583,p=0.000)呈明顯正相關(guān)。與血ALB(r=-0.485,p=0.001)呈負(fù)相關(guān)。與T-CHO(r=0.13,p=0.401)無關(guān)??崭笷FA與FBG(r=0.490,p=0.000)、TG(r=0.542,p=0.000)、TCHO(r=0.37,p=0.002)、24h尿白蛋白呈正相關(guān),與血白蛋白(ALB)呈負(fù)相關(guān)。
3、FABP4在1型糖尿病大鼠腎組織的表達(dá)及意義
12、 3.1一般參數(shù)、血糖和腎小球直徑:DM組大鼠的體重在2、4、8、12周明顯低于C組;其腎重、腎重/體重比值、血糖和腎小球直徑在上述時間點均明顯高于C組。
3.2形態(tài)學(xué)觀察:HE染色顯示DM組從第2周開始部分腎小管管腔出現(xiàn)蛋白管型,腎小管出現(xiàn)顆粒變性、空泡變性,第12周時這種改變最明顯。PAS染色顯示4周時DM組腎小球系膜基質(zhì)輕度增生,8周時系膜細(xì)胞輕度增多。
3.3腎小球和間質(zhì)ED1陽性細(xì)胞計數(shù):在2、4
13、、8周,DM組腎小球內(nèi)及腎皮質(zhì)間質(zhì)ED1陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于C組。
3.4 FABP4定位及定量觀察:免疫組化顯示第2周DM組近髓腎皮質(zhì)腎小管周圍毛細(xì)血管和小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞FABP4陽性表達(dá)數(shù)量增多,并向腎皮質(zhì)表面延伸。第4周可見部分腎小囊壁層上皮細(xì)胞胞漿和胞核及腎小球內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)FABP4陽性表達(dá)。腎皮質(zhì)Western blot定量結(jié)果顯示,從第2周開始各時間點DM組大鼠腎皮質(zhì)FABP4蛋白表達(dá)明顯高于C組大鼠。這種增加持續(xù)到
14、第8周。
3.5 OPN的表達(dá):免疫組化和Western blot結(jié)果顯示2、4、8周OPN在DM組和C組表達(dá)量無差別。
結(jié)論:
1、證實脂肪細(xì)胞FABP4表達(dá)豐富,與其他學(xué)者細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果一致;但只有肺組織中的巨噬細(xì)胞和少數(shù)肝臟枯氏細(xì)胞可見FABP4陽性表達(dá)。研究結(jié)果提示:巨噬細(xì)胞在病理狀態(tài)下FABP4表達(dá)與生理狀態(tài)下不一致。
2、首次系統(tǒng)觀察FABP4在正常Wistar大鼠各組
15、織中的定位及定量表達(dá);發(fā)現(xiàn)多個組織的毛細(xì)血管和小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞胞漿和胞核均有表達(dá);但組織不同,內(nèi)皮細(xì)胞陽性表達(dá)差異很大。這種表達(dá)差異的機制需進(jìn)一步探討。雖然文獻(xiàn)報道認(rèn)為血FABP4來源于脂肪細(xì)胞,我們的研究結(jié)果認(rèn)為微血管內(nèi)皮細(xì)胞也是血FABP4重要來源。
3、腎盂和膀胱的移行上皮細(xì)胞胞漿胞核、卵巢黃體細(xì)胞胞漿胞核和胰島細(xì)胞胞漿FABP4表達(dá)陽性。FABP4這種分布的廣泛性提示其功能的多樣性。
4、發(fā)現(xiàn)糖尿病第1
16、周即有空腹FABP4、FFA有意義增高,比空腹血糖值的升高更穩(wěn)定,說明脂質(zhì)代謝紊亂是糖尿病的早期事件,提示空腹FABP4、FFA可作為糖尿病早期診斷的指標(biāo)。
5、STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病,在腎病早期FABP4在腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿和胞核的表達(dá)量即增加,并隨糖尿病進(jìn)展表達(dá)形式發(fā)生了改變。這種高表達(dá)持續(xù)到第8周,而作為腎小管損傷標(biāo)記物的OPN,DM組表達(dá)量與對照組無差別。結(jié)果證實糖尿病腎損傷早期FABP4表達(dá)增加。進(jìn)一步將擬對
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