HGR13與SMARCB1蛋白的相互作用及其在細(xì)胞周期中的功能鑒定.pdf

1、目的:通過發(fā)現(xiàn)HGR13的相互作用蛋白，探究HGR13的功能;驗(yàn)證HGR13和SMARCB1的相互作用的真實(shí)性以及兩者相互作用的結(jié)構(gòu)域;根據(jù)SMARCB1的功能，探究HGR13的功能（細(xì)胞周期）。
　　 為了闡述該課題實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，特介紹以下為相關(guān)背景:在哺乳動物細(xì)胞核內(nèi)，DNA圍繞著組蛋白8聚體形成一個核小體結(jié)構(gòu)。這個核小體結(jié)構(gòu)成為許多跟DNA有關(guān)的生物過程的障礙，比如轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制，以及DNA修復(fù)。核小體結(jié)構(gòu)主要有兩類調(diào)控者，

2、一類是組蛋白乙酰化/去乙?；瘡?fù)合體(HATs/HDACs)---這些復(fù)合體能夠在和小體組蛋白的N-端進(jìn)行乙酰化，去乙酰化修飾---這一過程至今尚不完全清楚，比較明確的是，乙?；?，去乙?；苯佑绊懟虻霓D(zhuǎn)錄。還有一種染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合體，那就是SWI2/SNF2復(fù)合體。這個復(fù)合體的核心組分是一個ATP酶(Brg/Brm)，它可以依賴ATP水解的能量打開核小體的二級結(jié)構(gòu)。受SWI2/SNF2調(diào)節(jié)的基因在全基因組散在分布，說明SWI2/SNF2復(fù)

3、合體調(diào)節(jié)基因活性的方式不是打開某一區(qū)段很大的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)---例如巴式小體或者染色質(zhì)上的異染部分，而是隨時并且隨機(jī)調(diào)節(jié)各個基因所在染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)的。也就是說，SWI2/SNF2其實(shí)更像是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。SWI2/SNF2復(fù)合體除了DNA依賴的ATP酶(Brg/Brm)以外，還有一個核心組分，就是SMARCB1。這個組分含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且含有Rpt1，Rpt2兩個蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用。基因的表達(dá)調(diào)控是細(xì)胞內(nèi)最重

4、要的事件，細(xì)胞內(nèi)某一大分子的有無，或者量的變化，直接導(dǎo)致細(xì)胞的質(zhì)變。細(xì)胞因此而或增殖，或凋亡，或分化，或脫分化，或休眠，或活躍。
　　 在上世紀(jì)90年代，大規(guī)模cDNA文庫測序大大推動了基因研究。人HGR13就是在胎腦CDNA文庫中隨機(jī)測序得到的，這個基因定位于Xq22;根據(jù)其與小鼠HGR13基因家族成員的同源關(guān)系，命名為hHGR13[3]。人hGR13基因的表達(dá)產(chǎn)物是一個125aa的蛋白質(zhì)。人hGR13基因定位在22號染色體的

5、q臂，也就是X染色體短臂上，它在腦中表達(dá)很高，所以后來被命名為Brain expressed X-linked protein，再后來的研究中，發(fā)現(xiàn)這個蛋白跟HGR74是同源蛋白。HGR的命名源于---人生長因子受體相關(guān)蛋白，但實(shí)際上，韓春雨等人研究發(fā)現(xiàn)，這個蛋白跟人HGR74的功能相去甚遠(yuǎn)。HGR74主要表達(dá)在細(xì)胞漿，而HGR13主要表達(dá)在細(xì)胞核。HGR74的相互作用蛋白是生長因素受體，而HGR13主要的相互作用蛋白是轉(zhuǎn)錄因子。HGR

6、74的功能從目前來看，主要是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而HGR13的功能似乎主要是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。但根據(jù)命名原則，定名為HGR13。13主要是指這個蛋白大約13KD。
　　 對人HGR13蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明，HGR13分子量約為13kDa。此蛋白在人的腦和睪丸中有很高的表達(dá)，在其他器官，如肺，腎等部位，也有少量表達(dá)。從目前的數(shù)據(jù)庫來看，HGR13不存在明顯的功能性結(jié)構(gòu)域，C端具有一個富含亮氨酸的出核信號。我們對HGR13進(jìn)行的親疏水性分析表明

7、，該蛋白沒有大段的疏水區(qū)段，所以不可能是膜蛋白。軟件分析(P-SORT)其細(xì)胞亞定位表明，HGR13有60％的可能性定位于細(xì)胞核，40％的可能性定位于細(xì)胞漿。沒有其他細(xì)胞器的定位可能性。因此，我們推測，這個蛋白可能是一個位于細(xì)胞核的小分子，根據(jù)其亞細(xì)胞定位我們推測，HGR13蛋白可能和基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。
　　 本研究以HGR13為“誘餌”，應(yīng)用酵母雙雜交篩選與HGR13相互作用的蛋白，以期探究HGR13分子的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，

8、表觀遺傳相關(guān)蛋白SMARCB1是HGR13的相互作用蛋白。
　　 方法:酵母雙雜交篩選與HGR13的相互作用蛋白;體外GSTPull-down以及亞細(xì)胞定位分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其相互作用的真實(shí)性;細(xì)胞流式分析這一相互作用對細(xì)胞周期的影響。
　　 結(jié)果:本文以HGR13為“誘餌”蛋白，應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選HGR13的相互作用蛋白。我們的研究發(fā)現(xiàn)， SMARCB1直接且特異的與HGR13相互作用。 SMARCB1是染色質(zhì)重塑復(fù)合體

9、SWI/SNF的核心組分。SWI/SNF最初在上世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母中， SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合體是表觀遺傳分子機(jī)制中的重要一員;SWI/SNF的發(fā)現(xiàn)，揭開了人們對表觀遺傳學(xué)研究的熱潮。SWI/SNF復(fù)合體的核心作用是依賴ATP水解的能量打開核小體結(jié)構(gòu)，這樣就使轉(zhuǎn)錄因子等基因調(diào)節(jié)蛋白得以接近DNA;所以，它的核心組分是ATP酶。除此之外，SWI/SNF還有一個重要的核心組分就是SMARCB1，SMARCB1負(fù)責(zé)與多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

10、蛋白結(jié)合。在幾乎所有真核生物中，都發(fā)現(xiàn)有SMARCB1蛋白，可見其非常重要。SMARCB1有兩個反向重復(fù)結(jié)構(gòu)區(qū)域，即Rpt1和Rpt2。這兩個結(jié)構(gòu)在進(jìn)化中的保守性更高。Rpt1和Rpt2是結(jié)合各種蛋白的結(jié)構(gòu)平臺。
　　 我們的研究表明，HGR13與SMARCB1具有直接并且特異的相互作用。我們根據(jù)SMARCB1蛋白的結(jié)構(gòu)域構(gòu)建了一系列的缺失突變體對HGR13進(jìn)行相互租用分析，結(jié)果表明表明SMARCB1的Rpt1和Rpt2是HGR

11、13的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡分析亞細(xì)胞定位顯示，HGR13與SMARCB1都主要分布在細(xì)胞核之中，這表明二者之間的相互作用的功能可能參與基因表達(dá)調(diào)控的過程。本文進(jìn)一步對HGR13與SMARCB1之間的相互作用的功能進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)HGR13通過與SMARCB1的相互作用影響細(xì)胞周期。
　　 結(jié)論:
　　 1、HGR13是HGR13蛋白家族中與SMARCB1特異相互作用的蛋白。
　　 2、HGR1