電針對(duì)荷瘤小鼠自發(fā)性活動(dòng)晝夜節(jié)律時(shí)相特征的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、目的：研究荷瘤小鼠自發(fā)性活動(dòng)晝夜節(jié)律時(shí)相特征及電針干預(yù)對(duì)其節(jié)律的影響作用，并從電針對(duì)荷瘤小鼠視交叉上核（suprachiasmatic nucleus, SCN）核心生物鐘基因及部分節(jié)律輸出信號(hào)分子的影響探討電針對(duì)荷瘤小鼠自發(fā)性活動(dòng)晝夜節(jié)律影響作用的分子調(diào)控機(jī)制。
　　方法：（1）采用成都中醫(yī)藥大學(xué)時(shí)間生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的小動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)自動(dòng)記錄及分析系統(tǒng)以及美國Clocklab生物節(jié)律數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自發(fā)性活動(dòng)晝夜節(jié)律

2、進(jìn)行監(jiān)測和記錄。將篩選出的14只 C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為空白組和模型組，每組7只動(dòng)物。先將動(dòng)物在光暗交替狀態(tài)（LD）下馴化10天后關(guān)燈使動(dòng)物處于暗置狀態(tài)（DD）即自由運(yùn)行狀態(tài)，DD馴化10天后開始造模。（2）將MA-782小鼠乳腺癌細(xì)胞株接種于模型組小鼠左側(cè)腋下復(fù)制荷瘤小鼠模型，造模成功后在自由運(yùn)行狀態(tài)下繼續(xù)監(jiān)測節(jié)律7天，通過造模前后的節(jié)律參數(shù)變化的分析研究自由運(yùn)行狀態(tài)下荷瘤動(dòng)物自發(fā)性活動(dòng)晝夜節(jié)律時(shí)相特征。（3）將重新篩選出的56

3、只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和6個(gè)時(shí)相點(diǎn)電針組（CT0電針組、CT4電針組、CT8電針組、CT12電針組、CT16電針組、CT20電針組），每組7只動(dòng)物。動(dòng)物L(fēng)D馴化至造模過程同（1），造模方法同（2）。（4）造模成功后繼續(xù)監(jiān)測節(jié)律7天，第8天開始電針干預(yù)，選取“百會(huì)”和“長強(qiáng)”穴，頻率2/15Hz，電流0.5mA，每次15分鐘，每天電針1次，連續(xù)電針3天。電針操作結(jié)束后先自由運(yùn)行兩天以屏蔽掩蔽效應(yīng)，然后繼續(xù)監(jiān)測節(jié)律10

4、天，對(duì)電針前后的節(jié)律參數(shù)變化進(jìn)行分析，研究6個(gè)不同時(shí)相點(diǎn)電針對(duì)荷瘤小鼠自發(fā)性活動(dòng)晝夜節(jié)律的影響作用并篩選出電針效應(yīng)的最佳時(shí)相點(diǎn)，以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。（5）將重新篩選出的36只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和電針組，每組12只動(dòng)物。動(dòng)物L(fēng)D馴化至造模過程同（1）和（2），電針時(shí)間選擇CT16，電針方法同（4），第三次電針后2h處死動(dòng)物取材保存待測。（6）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組動(dòng)物SCN內(nèi)生物鐘基因Per1、Per2、P

5、er3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1以及瘤組織內(nèi)生物鐘基因Per1和Per2的相對(duì)表達(dá)量。采用 Elisa法檢測各組動(dòng)物 SCN、外周血清和瘤組織內(nèi) SCN輸出信號(hào)分子TGFα和PK2水平。
　　結(jié)果：（1）造模前，各組動(dòng)物自發(fā)性活動(dòng)晝夜節(jié)律的周期、中值、振幅、相位和總活動(dòng)度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05），其自發(fā)性活動(dòng)表現(xiàn)出明顯近似晝夜節(jié)律性。（2）造模后，模型組動(dòng)物自發(fā)性活動(dòng)晝夜節(jié)律振幅和總活動(dòng)度降低且相位超前，造

6、模前后振幅差值、總活動(dòng)差值和相位移動(dòng)值與空白組比較其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.05），而造摸前后周期差值和中值差與空白組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。（3）電針后，電針組動(dòng)物自發(fā)性活動(dòng)晝夜節(jié)律降低的振幅提高，超前的相位滯后，電針前后振幅差值和相位移動(dòng)值與模型組比較其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.05），六個(gè)不同時(shí)相點(diǎn)中以CT16電針效應(yīng)最為明顯。而電針組動(dòng)物電針前后周期差值、中值差值和總活動(dòng)度差值與模型組比較其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

7、義（p＞0.05）。（4）造模后，模型組動(dòng)物SCN內(nèi)核心生物鐘基因Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock和Bmal1的表達(dá)均具有下調(diào)趨勢，但Per1mRNA、Per2mRNA、Per3mRMA、Cry1mRNA、Cry2mRNA、ClockmRNA和Bmal1mRNA相對(duì)表達(dá)量與空白組比較其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。電針后，電針組動(dòng)物SCN內(nèi)Per2和Cry1基因表達(dá)上調(diào)，Per2mRNA和Cry1mRN

8、A相對(duì)表達(dá)量與模型組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p﹤0.05）；而Per1、Per3、Cry2、Clock和Bmal1基因表達(dá)均具有上調(diào)趨勢，但Per1mRNA、Per3mRNA、Cry2mRNA、ClockmRNA和Bmal1mRNA相對(duì)表達(dá)量與模型組比較其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。（5）造模后，模型組動(dòng)物瘤組織內(nèi)Per1基因表達(dá)下調(diào)，Per1mRNA相對(duì)表達(dá)量與空白組比較其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.05）；模型組動(dòng)物瘤組織內(nèi)P

9、er2基因表達(dá)明顯下調(diào)，Per2mRNA相對(duì)表達(dá)量與空白組比較其差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.01）。電針后，電針組動(dòng)物瘤組織內(nèi)Per1和Per2基因表達(dá)未見明顯上調(diào)，Per1mRNA和Per2mRNA相對(duì)表達(dá)量與模型組比較其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。（6）造模后，模型組動(dòng)物SCN內(nèi) TGFα水平較空白組有所增高，但與空白組比較其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）；造模組動(dòng)物外周血清 TGFα水平較空白組明顯增高，與空白組比較

10、其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.05）；造模組動(dòng)物瘤組織內(nèi)TGFα水平較空白組明顯增高，與空白組比較其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.05）。電針后，電針組動(dòng)物SCN、外周血清和瘤組織內(nèi)TGFα水平均無明顯變化，與模型組比較其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。（7）造模后，模型組動(dòng)物SCN、外周血清PK2水平明顯降低，與空白組比較其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.05）；模型組動(dòng)物瘤組織內(nèi)PK2水平較空白組有所降低，但與空白組比較其差異均無統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)意義（p＞0.05）。電針組動(dòng)物SCN和外周血清內(nèi)PK2水平均明顯增高，與模型組比較其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.05）；電針組動(dòng)物瘤組織內(nèi)PK2水平較模型組有所增高，但與模型組比較其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　結(jié)論：C57BL/6J小鼠荷瘤后，其自發(fā)性活動(dòng)晝夜節(jié)律具有一定程度的改變，其時(shí)相特征表現(xiàn)為振幅及總活動(dòng)度降低、相位超前。自由運(yùn)行狀態(tài)下，電針可以在一定程度上恢復(fù)荷瘤小鼠自發(fā)性活動(dòng)晝夜節(jié)律降低的振幅，并使超前