柑橘潰瘍病微滴數(shù)字PCR與定量PCR檢測方法的比較研究.pdf

1、柑橘潰瘍病是一種由柑橘黃單胞桿菌柑橘變種(Xanthomononas citri subsp. citri, Xcc）引起的細(xì)菌性病害，該病會導(dǎo)致落葉、樹勢衰退、落果、果實(shí)產(chǎn)生潰瘍斑、品質(zhì)變差等癥狀，嚴(yán)重影響柑橘的產(chǎn)量和商品價(jià)值是威脅全球柑橘產(chǎn)業(yè)的的重大檢疫性病害。該病主要通過帶菌種苗或接穗遠(yuǎn)距離傳播，而田間近距離擴(kuò)散主要與暴風(fēng)雨或農(nóng)事活動有關(guān)。柑橘潰瘍病菌在枝、葉、果實(shí)等部位的存活時(shí)間比較長，這對于該病害的檢驗(yàn)檢疫和防治防控是巨大的挑

2、戰(zhàn)。目前，柑橘潰瘍病的檢測主要依賴定量PCR技術(shù)。定量PCR技術(shù)具有較高的特異性、靈敏性、閉管反應(yīng)等優(yōu)勢，但仍存在技術(shù)方法的局限性，諸如依賴外部參照（核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或?qū)φ諛颖荆┎拍芏浚躊CR擴(kuò)增效率變化影響大，易受PCR抑制物影響，以及假陰性等問題。因此定量PCR并不能很好地滿足植物病害檢驗(yàn)檢疫工作的需要。微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)技術(shù)是第三代核酸定量檢測技術(shù)，采用PCR終點(diǎn)檢測和泊松分布原

3、理實(shí)現(xiàn)核酸樣本的絕對定量，具有更高的精確性、特異性以及靈敏度，無需標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，無需標(biāo)建立準(zhǔn)曲線，不依賴PCR擴(kuò)增效率，不易受PCR抑制劑的影響，能準(zhǔn)確測定低豐度樣本拷貝數(shù)。目前，ddPCR在醫(yī)學(xué)臨床診斷上的應(yīng)用逐漸興起，但在植物學(xué)研究、植物病害檢驗(yàn)檢疫方面的報(bào)道很少。本研究旨在評估微滴數(shù)字PCR與定量PCR兩種方法在柑橘潰瘍病檢測應(yīng)用中的各項(xiàng)性能，為柑橘潰瘍病的快速鑒定、病害預(yù)測預(yù)報(bào)、病害流行學(xué)研究以及Xcc標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備提供更為有效的技

4、術(shù)方法。
　　本研究主要內(nèi)容包括：①檢測特異性和靈敏度：以柑橘葉片腐生非致病菌為對照，驗(yàn)證了引物和探針的特異性。比較兩種方法對系列稀釋的Xcc菌懸液和質(zhì)粒DNA的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法均具有很好的線性。雖qPCR的動態(tài)范圍比ddPCR廣，但是ddPCR的靈敏度比qPCR高。ddPCR對菌懸液和質(zhì)粒DNA的檢測下限分別為5 CFUs/20μL和6.4 copies/20μL；而qPCR對菌懸液和質(zhì)粒DNA的檢測下限分別為36 CFU

5、s/20μL和12 copies/20μL。②DNA模板構(gòu)象的影響：對比相同拷貝數(shù)濃度的酶切線性化質(zhì)粒和環(huán)狀質(zhì)粒的qPCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)狀質(zhì)粒的Cq值會顯著大于線性質(zhì)粒的Cq值，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低；而盡管環(huán)狀質(zhì)粒會使ddPCR的1-Dimension散點(diǎn)圖上出現(xiàn)較多的“雨點(diǎn)（Rainning）”，但定量結(jié)果與相同拷貝數(shù)濃度的線性質(zhì)粒DNA無顯著差別。③檢測重復(fù)性：對高、中、低不同濃度的質(zhì)粒和菌懸液樣品重復(fù)定量三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ddPCR比

6、qPCR具有更好的重復(fù)性，其變異系數(shù)降低了9.19％–69.44%。④PCR抑制物耐受性：對于柑橘組織液、王銅殺菌劑、硫酸銅溶液三種PCR抑制劑，ddPCR表現(xiàn)出對PCR抑制成分的更高耐受度，定量結(jié)果不易受抑制因子干擾，這與ddPCR在PCR終點(diǎn)檢測熒光信號以及基于泊松分布概率密度函數(shù)的數(shù)學(xué)模型有關(guān)。⑤田間樣品實(shí)測：回歸分析表明，對于相同的樣本，ddPCR與qPCR的檢測結(jié)果相關(guān)性較強(qiáng)（皮爾遜相關(guān)系數(shù)R2=0.7453，P<0.001）