下牙槽神經(jīng)缺失對(duì)下頜骨骨缺損骨痂血腫期炎癥因子表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、在骨缺損愈合過程中,神經(jīng)系統(tǒng)一直參與調(diào)控骨痂的纖維化、軟骨形成、骨礦化改建等過程,尤其是通過周圍神經(jīng)末梢分泌的神經(jīng)肽與局部其他細(xì)胞因子共同作用于局部骨痂組織,影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化和功能,完成對(duì)新骨形成和改建的調(diào)控作用[1-2]。近年來的研究證實(shí),降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitoningene-relatedpeptideCGRP)是周圍神經(jīng)分泌的神經(jīng)肽之一,在新骨形成改建過程中發(fā)揮著重要作用[3]。本課題組前期研究證實(shí),下牙槽神

2、經(jīng)(InferioralveolarnerveIAN)能夠通過CGRP調(diào)控NO/NOi、OPG/RANKL等細(xì)胞信號(hào)通路,影響局部骨痂改建、新骨形成,從而影響下頜骨骨缺損的愈合[4-5]。
　　炎癥是機(jī)體對(duì)損傷因子的一種病理性防御反應(yīng),在局部骨缺損處的血腫形成新骨的過程中,炎癥因子始終以自分泌和旁分泌的形式,參與控制骨痂的改建[6]。下牙槽神經(jīng)缺失是否影響早期神經(jīng)肽CGRP分泌?CGRP表達(dá)變化是否影響骨痂血腫期炎癥因子的表達(dá)變化

3、?國(guó)內(nèi)外還鮮有報(bào)道,本研究通過建立失IAN和保留IAN兔下頜骨骨缺損動(dòng)物模型[7],探討CGRP對(duì)骨缺損骨痂血腫期炎癥因子的影響,進(jìn)一步探討周圍感覺神經(jīng)調(diào)控骨缺損愈合的可能機(jī)制,并檢測(cè)下頜骨骨缺損血腫周圍局部骨組織中,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)及其mRNA表達(dá)和神經(jīng)肽CGRP的表達(dá),探討周圍神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)下頜骨骨缺損愈合影響的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組<

4、br>　　成年中國(guó)大白兔50只,體重1.9kg~2.1kg,雌雄不限,由第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組為左下牙槽神經(jīng)缺失并左下頜骨骨缺損;對(duì)照組為單純左下頜骨骨缺損,實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)設(shè)為1d、2d、3d、5d、7d,在實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)快速處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,快速切取骨缺損區(qū)周圍2mm骨組織,液氮保存待用。
　　2、ELISA法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)。

5、　　3、熒光realtime-PCR法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)。
　　4、HE染色觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)局部骨痂組織變化,免疫組化法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)局部骨痂周圍骨組織CGRP表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)
　　1.1IL-1β表達(dá):骨缺損后1d,實(shí)驗(yàn)組表達(dá)降低,與對(duì)照組相比具有非常顯著差

6、異(P<0.01);2d實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組(P<0.05),表達(dá)有顯著差異(P<0.05);5d時(shí)實(shí)驗(yàn)組表達(dá)高于對(duì)照組,相比有顯著差異(P<0.05);3d、5d兩組相比無明顯差異。
　　1.2IL-6表達(dá):骨缺損后1d,IL-6實(shí)驗(yàn)組表達(dá)降低,與對(duì)照組相比具有非常顯著差異(P<0.01);骨缺損后2d,實(shí)驗(yàn)組表達(dá)低于對(duì)照組,兩組相比有顯著差異(P<0.05);3d、5d、7d兩組之間無明顯差異。
　　1.3TNF-α表達(dá)

7、:骨缺損后1d,實(shí)驗(yàn)組表達(dá)低于對(duì)照組,兩組之間具有非常顯著差異(P<0.01);2d時(shí)兩組之間無顯著差異,實(shí)驗(yàn)組表達(dá)升高,對(duì)照組表達(dá)降低,而實(shí)驗(yàn)組與1d實(shí)驗(yàn)組相比,具有非常明顯差異;3d實(shí)驗(yàn)組表達(dá)低于對(duì)照組,兩組相比具有顯著差異(P<0.05);5d實(shí)驗(yàn)組表達(dá)高于對(duì)照組,兩組相比具有顯著差異(P<0.05),7d時(shí)則無明顯差異。
　　2.熒光realtime-PCR法檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)
　　2.

8、1IL-1βmRNA表達(dá):1d、2d、3d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,表達(dá)降低,具有非常顯著差異(p<0.01);5d實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組,兩組相比表達(dá)具有顯著差異(p<0.05);7d兩組表達(dá)無明顯差異。
　　2.2IL-6mRNA表達(dá):1d、2d、3d、5d實(shí)驗(yàn)組表達(dá)低于對(duì)照組,具有非常顯著差異(p<0.01);7d兩組表達(dá)相比無明顯差異;隨時(shí)間延長(zhǎng)兩組表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。
　　2.3TNF-αmRNA表達(dá):1d實(shí)驗(yàn)組表達(dá)低于對(duì)照組,

9、具有非常顯著差異(p<0.01);2d、5d兩組相比表達(dá)具有顯著差異(p<0.05);3d、7d兩組相比表達(dá)無明顯差異;二組隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。
　　3.HE染色:1d,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨缺損區(qū)充滿血細(xì)胞,邊緣可見大量炎性細(xì)胞出現(xiàn);2d實(shí)驗(yàn)組骨缺損區(qū)邊緣可見由纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)組織出現(xiàn),較對(duì)照組少,其間散在大量的炎性細(xì)胞;3d骨缺損區(qū)邊緣纖維組織進(jìn)一步增寬,血細(xì)胞量減少,對(duì)照組內(nèi)血細(xì)胞基本吸收完畢,由纖維組織代替;5d實(shí)驗(yàn)

10、組骨缺損區(qū)纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)較對(duì)照組寬;7d實(shí)驗(yàn)組大量纖維組織增生,有少量編織骨形成,成熟度不高,中心位置還有少量纖維組織,對(duì)照組已完全由結(jié)締組織代替,可見在成纖維細(xì)胞簇集的部位有少量的骨基質(zhì)沉積,較多的編織骨形成。
　　4.免疫組化法檢測(cè)CGRP(AOD)表達(dá):1d、3d、7d實(shí)驗(yàn)組表達(dá)與對(duì)照組相比,具有顯著差異(p<0.05);2d、5d兩組相比具有非常顯著差異(p<0.01);各實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組表達(dá)鈞低于對(duì)照組。
　　結(jié)論: