腸道內(nèi)硫酸鹽還原菌的多樣性分析.pdf

1、硫酸鹽還原菌(sulfate reducing bacteria, SRB)是一類以硫酸鹽為呼吸鏈終端電子受體從而氧化有機物和氫氣以獲取能量的一類厭氧微生物。硫酸鹽還原菌不僅抑制丁酸鹽的產(chǎn)生,而且消耗腸道內(nèi)已有的丁酸鹽;硫酸鹽還原菌的主要產(chǎn)物之一是硫化氫(H2S),它調(diào)節(jié)胰島素的分泌、抑制丁酸鹽的氧化、影響動物細胞的呼吸、對動物細胞有遺傳毒性和細胞毒性;革蘭氏陰性菌硫酸鹽還原菌的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘發(fā)

2、炎癥的能力強。硫酸鹽還原菌的這些特性都表明它可能是腸道內(nèi)具有重要功能的一類細菌。已有報道顯示SRB可能與結(jié)腸炎、結(jié)腸癌、腸道易激綜合征、代謝綜合征等疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
　　本研究的第一部分內(nèi)容是建立腸道硫酸鹽還原菌的DGGE分析技術(shù)。依據(jù)文獻挑選了兩對硫酸鹽還原菌腺苷酰硫酸還原酶α亞基基因(adenosine-5'-phosphosulfate reductase alpha subunit gene, aprA)的特異性引物:

3、AprA-1-FW/ AprA-5-RV和AprA-3-FW/ APS-RV。從GenBank中下載了13株脫硫弧菌科細菌的aprA的序列,利用Clustal X、Simulated PCR(SPCR)軟件比較、評估了這2對引物用于擴增糞便樣品中的SRB的特異性。它們的結(jié)果均表明引物 AprA-3-FW/ APS-RV優(yōu)于AprA-1-FW/AprA-5-RV。實際 PCR的結(jié)果也顯示AprA-1-FW/AprA-5-RV擴增效率低并有

4、非特異擴增。在此基礎(chǔ)上建立DGGE體系,對10例健康人腸道中SRB的分析顯示,每個個體腸道中SRB的種類有1到5種不等,這表明基于aprA序列的DGGE技術(shù)是分析腸道SRB組成的有效方法。
　　本研究的第二部分內(nèi)容是分離培養(yǎng)人腸道中的SRB菌株并分析其多樣性組成。選擇1名糖尿病患者(D)、1名健康老年人(S)和1名健康青年人(H)作為分菌對象,采集新鮮糞便樣品進行SRB的分離。從糖尿病患者樣品中分離得到了150株SRB菌株分屬4種

5、ERIC-PCR型;從健康老年人樣品中分離到96株SRB菌株,分屬2種ERIC-PCR型;健康青年人志愿者的樣品中未能分離到SRB菌株。對分離株的代表菌株進行16S rRNA基因全長和aprA基因片段的測序,通過GenBank Blast、系統(tǒng)進化樹等分析確定這些菌株都屬于脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)細菌。本研究也對3名志愿者腸道中的SRB組成進行了aprA基因的克隆文庫分析和DGGE分析,并與培養(yǎng)的結(jié)果進行了比較。結(jié)果顯示

6、,從糖尿病患者樣品中分離到的SRB菌株與D. intestinalis99％相似,是該樣品中SRB的一種優(yōu)勢種;從健康老年人樣品中分離到的菌株與D. desulfuricans99%同源,是該樣品中最主要的一種SRB;健康青年人樣品雖未分離到SRB菌株,但分子檢測顯示其含有 D. desulfuricans等類型。與培養(yǎng)方法相比,克隆文庫分析和DGGE等分子技術(shù)分析SRB更全面,SRB的多樣性也高于培養(yǎng)方法的結(jié)果。
　　綜上所述,