MiR-217對(duì)乳腺癌上皮細(xì)胞甲基化關(guān)鍵基因調(diào)控作用的研究.pdf

1、目的:探討在人乳腺癌上皮細(xì)胞系中,miR-217通過(guò)直接作用于DNMT1與EZH23′UTR調(diào)控DNMT1及EZH2轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平,為后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:首先利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),檢測(cè) HBL-100、MCF-7和 MDA-MB-231三株人乳腺上皮細(xì)胞系中miR-217和EZH2轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平;利用Western blot技術(shù)檢測(cè)三株細(xì)胞系中EZH2蛋白表達(dá)水平;篩選用于“過(guò)表達(dá)、抑制miR-217

2、實(shí)驗(yàn)”的細(xì)胞。然后利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù),在低表達(dá)miR-217細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染miR-217模擬物;在高表達(dá)miR-217細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染miR-217抑制物,進(jìn)行miR-217的過(guò)表達(dá)、抑制實(shí)驗(yàn)。最后,將含有miR-217野生型及突變型識(shí)別位點(diǎn)的DNMT1及EZH23′UTR質(zhì)粒載體,分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,檢測(cè)其相對(duì)熒光素酶活性的改變。
　　結(jié)果:RT-PCR結(jié)果顯示,與正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100比較,EZH2在乳腺癌上皮細(xì)胞系MCF

3、-7和MDA-MB-231中顯著高表達(dá)(P<0.05);而miR-217顯著低表達(dá)(P<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,EZH2在正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100中低表達(dá),乳腺癌上皮細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231中高表達(dá)。三陰性乳腺癌上皮細(xì)胞系MDA-MB-231中過(guò)表達(dá)miR-217,DNMT1和EZH2蛋白表達(dá)下降;乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100中抑制miR-217表達(dá),DNMT1和EZH2蛋白表達(dá)增高。29