HIV-1來源的慢病毒載體介導(dǎo)綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、目的:探索人臍帶血血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定的方法；探討HIV-1來源的慢病毒載體介導(dǎo)綠色熒光蛋白(GFP)基因轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的可行性和方法。
　　 方法:采用密度梯度離心法和貼壁細(xì)胞分離法相結(jié)合,分離和篩選出人臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞,用EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)、擴(kuò)增,采用細(xì)胞免疫熒光染色和流式細(xì)胞儀檢測內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)記CD133、CD34、VEGFR-2的方法鑒定實驗培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞。取生長活躍的EPCs,以

2、HIV-1來源的慢病毒為載體,以綠色熒光蛋白(GFP)基因為目的基因轉(zhuǎn)染EPCs。感染復(fù)數(shù)MOI分別為:1:10,1:50,1:100,MTT法檢測不同病毒滴度時細(xì)胞增殖情況,計算轉(zhuǎn)染率；取1:50轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染的空白組進(jìn)行對照,于轉(zhuǎn)染后1-10天觀察兩組細(xì)胞增殖情況。用t檢驗、卡方檢驗、方差分析等方法對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:單個核細(xì)胞經(jīng)EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)一周后,即分化成CD133、KDR和CD34陽

3、性的EPCs。1:10轉(zhuǎn)染和1:50轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖無明顯影響,細(xì)胞顯綠色熒光。1:10比率轉(zhuǎn)染后48小時綠色熒光細(xì)胞比率僅(35.2±2.75)％；1:50比率轉(zhuǎn)染后48小時熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率為(87.4±1.89)％,轉(zhuǎn)染率高于1:10組(P<0.05)。1:50轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)并與未轉(zhuǎn)染組對照,顯示兩組細(xì)胞生長曲線無明顯差異(P>0.05)。1:100比率轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞的增殖處于停滯狀態(tài),鏡下可見細(xì)胞壞死形成碎片。結(jié)論:1、采