CYP4F2基因調(diào)控區(qū)單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)聯(lián)研究及功能鑒定.pdf

1、目的：原發(fā)性高血壓(EssentialHypertension，EH)又稱高血壓病，是一種病因尚未完全明確的，嚴(yán)重威脅人類生存健康的常見復(fù)雜疾病，其作為一種多因素常見復(fù)雜疾病，是個體的遺傳易感性和環(huán)境致病因子共同作用的結(jié)果，因此，與環(huán)境代謝相關(guān)的高血壓病候選基因的關(guān)聯(lián)研究和功能鑒定，有助于闡明這一常見復(fù)雜疾病的致病機(jī)制。 細(xì)胞色素P4504F2(cytochromeP450，CYP4F2)是環(huán)境代謝酶細(xì)胞色素P450超家族成員之

2、一，是人體腎臟代謝花生四烯酸(arachidonicacid，AA)產(chǎn)生20-羥二十碳四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoicacid，20-HETE)的主要代謝酶。20-HETE具有多種血管活性，并參與調(diào)節(jié)腎臟的水鈉平衡，進(jìn)而影響全身血壓。有學(xué)者在高血壓小鼠模型基因敲除和基因芯片的研究中發(fā)現(xiàn)，CYP4家族基因表達(dá)存在差異。最近有學(xué)者發(fā)現(xiàn)人類的另一個20-HETE合成酶基因(CYP4A11)上的一個單核苷酸多態(tài)性(s

3、inglenucleotidepolymorphism，SNP)(T8590C)與EH發(fā)生相關(guān)。目前，關(guān)于CYP4F2基因和EH的關(guān)聯(lián)分析及功能研究尚未見報道。 本研究以CYP4F2基因的調(diào)控區(qū)SNP為切入點(diǎn)，分析了CYP4F2基因在中國東北高血壓高發(fā)區(qū)相對獨(dú)立人群中的常見單體型構(gòu)成，并進(jìn)行了以病例-對照人群和高血壓家系為基礎(chǔ)的CYP4F2基因與EH的關(guān)聯(lián)研究。本研究還利用軟件預(yù)測、報告基因表達(dá)載體構(gòu)建和EMSA等方法分析了CY

4、P4F2基因的調(diào)控區(qū)功能，并對其中兩個功能性SNP(G421C和T378C)進(jìn)行了鑒定，以最終明確P450代謝途徑在EH致病機(jī)制中的作用。 材料與方法1.自遼寧省彰武縣高血壓病高發(fā)區(qū)漢族人群中，選取高血壓病患者和健康對照共計548人進(jìn)行病例-對照研究。其中，高血壓病組271人(男128人，女143人)，除外繼發(fā)性因素；健康對照組277人(男128人，女149人)，收縮壓＜140mmHg，舒張壓＜90mmHg，無服用抗高血壓藥物史

5、。此外還收集了66個高血壓家系，共275人。 2.飽和氯化鈉法提取基因組DNA；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)方法擴(kuò)增CYP4F2基因第1內(nèi)含子調(diào)控區(qū)(+260～+887)；隨機(jī)選取病例-對照人群中的130個PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序；應(yīng)用限制性片段長度多態(tài)方法(限制性內(nèi)切酶ApaⅠ)對其余病例-對照人群和高血壓家系進(jìn)行G421C多態(tài)性的基因型分析。 3.PCR克隆構(gòu)建CYP4F2

6、基因調(diào)控區(qū)的不同基因型和不同片段長度的氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(chloramphenicolacetyltransferase，CAT)報告基因表達(dá)載體，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人胚腎HEK293細(xì)胞，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗檢測CAT表達(dá)。利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活細(xì)胞NF-κB信號通路。 4.電泳泳動遷移分析(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)鑒定CYP4F2基因調(diào)

7、控區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件?？焖傩×恐苽浞ㄖ苽銱EK293細(xì)胞核提取物。快速凍融法提取c-Myb重組表達(dá)蛋白。設(shè)計合成CYP4F2基因序列+421和+378兩個多態(tài)位點(diǎn)處的寡核苷酸，經(jīng)復(fù)性和末端標(biāo)記后與HEK293細(xì)胞核提取物(或c-Myb重組蛋白)混合，冰上結(jié)合30分鐘后進(jìn)行電泳和放射自顯影檢測。競爭實(shí)驗用于判斷特異性結(jié)合帶；以c-Myb重組蛋白作為陽性對照，鑒定Myb-DNA復(fù)合物；以NF-κBConsensus序列作為陽性探針對照，并使

8、用NF-κB亞基之一p50的抗體，鑒定NF-κB與調(diào)控元件的特異性結(jié)合。 5.x2-檢驗用于計數(shù)資料的關(guān)聯(lián)分析和Hardy-Weinberg平衡檢驗，t-檢驗用于臨床指標(biāo)差異的顯著性判定。Logistic回歸分析用于評價不同基因型個體的高血壓患病風(fēng)險。各臨床指標(biāo)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有統(tǒng)計學(xué)運(yùn)算由SPSS10.0forwindows軟件完成。PHASE(version2.0)軟件用于單體型重建，HaploXT1.1軟件用于連鎖不

9、平衡分析，HAPLOBLOCK軟件用于單體型模塊鑒定。TDT-STDTProgram1.1軟件用于高血壓家系分析。MatchTM(publicversion1.0)軟件用于預(yù)測基因調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。 結(jié)果1.在病例-對照人群中體重指數(shù)、血清甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白水平在EH組均升高，而高血壓家系中血清總膽固醇和低密度脂蛋白水平與EH發(fā)生相關(guān)。 2.在130個測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)CYP4F2基因調(diào)控區(qū)存在7個DN

10、A序列變異，其中6個位點(diǎn)位于第1內(nèi)含子內(nèi)(T378C、T392C、G421C、C426T、G446A和T456C)，1個位于第2外顯子(T502G)并造成了第12位氨基酸的W12G替換。這7個序列變異中的4個(T378C、G421C、T456C和T502G)在人群中的頻率超過了1％定義為SNP。應(yīng)用軟件的聯(lián)合分析結(jié)果顯示，各SNP之間存在強(qiáng)烈的連鎖不平衡，共處同一單體型模塊中，構(gòu)成兩種常見單體型，主要單體型major-Hap：TGTF和

11、次要單體型minor-Hap：CCCG，因而可以將G421C多態(tài)位點(diǎn)作為單體型的標(biāo)簽SNP，分別代表這兩種常見單體型進(jìn)行大規(guī)模人群的基因型分析。 3.CYP4F2基因G421C位點(diǎn)的基因型分布在病例-對照人群和高血壓家系中均符合Hardy-Weinberg平衡；在病例-對照關(guān)聯(lián)研究中，421G等位基因在EH組的頻率(89.9％)高于對照組(85.9％)(p＜0.05)，GG純合子基因型在EH組的分布(80.4％)也明顯高于對照組

12、(72.9％)(p＜0.05)，Logistic回歸分析結(jié)果顯示421G純合子基因型是EH發(fā)生的獨(dú)立危險因素之一，攜帶該基因型的個體患病風(fēng)險高(OR=1.85，95％CI1.19～2.88，P＜0.05)。另外421GG基因型個體的舒張壓平均水平比其他基因型高2.85mmHg，差異有顯著性。TDT分析結(jié)果顯示421G等位基因由父母傳遞給患病子女的實(shí)際頻率明顯高于預(yù)期(x2=5.23，P＜0.05)與同胞對TDT的聯(lián)合分析結(jié)果也證實(shí)了42

13、1G與EH相關(guān)(z'=2.70，P＜0.05)。 4.CYP4F2基因調(diào)控區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn)CYP4F2基因第1內(nèi)含子G421C位點(diǎn)存在潛在的Myb轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件，且改變結(jié)合功能。EMSA結(jié)果顯示421G探針能與HEK239細(xì)胞核提取物及c-Myb重組蛋白反應(yīng)形成蛋白-DNA復(fù)合物，而421C探針不具備結(jié)合該轉(zhuǎn)錄因子的活性。 5.針對CYP4F2基因調(diào)控區(qū)Myb轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)元件構(gòu)建了包含G421C位點(diǎn)(+414～+372)

14、的單雙拷貝CAT報告基因載體(p49G-CAT、p49C-CAT、p49G×2-CAT和p49C×2-CAT)，轉(zhuǎn)染后CAT檢測顯示這四種DNA片段均具有轉(zhuǎn)錄活性，等位基因之間相比421G轉(zhuǎn)錄活性低于421C，雙拷貝片段轉(zhuǎn)錄活性低于單拷貝片段。 6.軟件預(yù)測分析還顯示第1內(nèi)含子T378C位點(diǎn)存在潛在的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件，并受多態(tài)性的影響。EMSA結(jié)果發(fā)現(xiàn)378T探針能與NF-κB兩種二聚體(p65/p50和p50/p50

15、)結(jié)合，而378C探針僅能形成一種NF-κB(p50/p50)-DNA復(fù)合物。 7.構(gòu)建了不同單體型的CYP4F2基因調(diào)控區(qū)5'端系列缺失型CAT報告載體(p564major-CAT、p564minor-CAT、p219major-CAT、p219minor-CAT、p67major-CAT和p67minor-CAT)，轉(zhuǎn)染后CAT檢測顯示，調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄活性隨著5'端截短而降低，564-bp片段最高，67-bp片段最低；對ma

16、jor-Hap和minor-Hap進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，p219-CAT差異最大，p219major-CAT比p219minor-CAT高35.93％(P＜0.05)；p67-CAT的差異趨勢與p49-CAT相似(major-Hap比minor-Hap低)；LPS處理對含有NF-κB轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)元件序列(p564-CAT和p219-CAT)轉(zhuǎn)錄活性均表現(xiàn)為上調(diào)作用；major-Hap單體型的轉(zhuǎn)錄活性對LPS刺激后上調(diào)的程度比minor-Hap單

17、體型高。 結(jié)論1.CYP4F2基因調(diào)控區(qū)存在7個DNA序列變異，構(gòu)成兩個常見SNP單體型(major-Hap和minor-Hap)；major-Hap的個體易感EH。 2.CYP4F2基因第1內(nèi)含子G421C位點(diǎn)改變了Myb轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)元件的DNA-蛋白結(jié)合親和力，使含有421G短調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄活性低于421C短調(diào)控序列。 3.CYP4F2基因第1內(nèi)含子T378C位點(diǎn)改變了反應(yīng)元件與NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合模式，