小反芻獸疫抗體及抗原診斷方法的初步建立.pdf

1、小反芻獸疫（PPR）是由小反芻獸疫病毒（PPRV）引起的一種急性、烈性、具有高度傳染性的疾病，主要感染山羊和綿羊。該病自1942年在非洲報(bào)道以來(lái)，迅速蔓延至全球的大多數(shù)國(guó)家，而我國(guó)2007年也首次爆發(fā)了PPR疫情，至今全國(guó)也已有二十多個(gè)省份頻繁發(fā)生PPR疫情。目前，針對(duì)PPR尚無(wú)有效的治療方法，仍然主要依靠疫苗來(lái)預(yù)防該疾病，因此建立快速的PPR抗原及抗體診斷方法對(duì)于疫情的診斷與抗體篩查具有重要意義。本論文主要完成了兩種診斷方法的初步建立

2、及應(yīng)用探索：
　?。?）利用原核表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)PPRV-H蛋白和PPRV-N蛋白。獲取相應(yīng)的目的基因，連接原核表達(dá)載體pET-30a，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-H和pET-30a-N，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析表明兩種重組蛋白均以包涵體形式表達(dá)。在純化過(guò)程中由于PPRV-H重組蛋白吸附鎳柱失敗，最終選擇SDS-PAGE切膠回收純化。PPRV-N蛋白能夠

3、成功使用鎳柱純化，咪唑使用濃度為300mM。純化后的重組蛋白分別進(jìn)行Western blot分析鑒定，結(jié)果表明，表達(dá)的PPRV-H蛋白和PPRV-N蛋白均具有良好的反應(yīng)原性。
　　利用純化后的PPRV-H蛋白包被ELISA酶標(biāo)板，分別對(duì)抗原包被濃度、血清稀釋濃度、酶標(biāo)二抗稀釋濃度、抗原抗體反應(yīng)時(shí)間、酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。做批內(nèi)及批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果變異系數(shù)均小于10％，說(shuō)明該方法具有較好的可重復(fù)性。檢測(cè)羊口瘡、羊痘、藍(lán)舌病和山羊

4、支原體血清結(jié)果均為陰性，說(shuō)明該方法具有良好的特異性。檢測(cè)臨床血清樣品80份，并與國(guó)外c-ELISA試劑盒（英國(guó) Pirbright實(shí)驗(yàn)室研制）比較，符合率為93.75%。因此，本方法可以用于小反芻獸疫的臨床血清抗體檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查。
　?。?）利用純化后的PPRV-H蛋白和PPRV-N蛋白分別免疫兔子、PPRV活疫苗免疫綿羊獲得相應(yīng)的高免血清。利用G蛋白親和層析柱純化血清IgG,標(biāo)記納米磁珠，制備相應(yīng)的免疫磁珠，結(jié)合RT-PCR