甲真菌病診斷方法的改良及致病菌毒力相關(guān)因子的初步研究.pdf

1、甲真菌病是皮膚科的常見病和多發(fā)病，真菌學(xué)檢查是確診的主要依據(jù)，但現(xiàn)有方法尚難以滿足臨床的需要；此外，對(duì)該病致病菌毒力因子的研究仍處于起步階段，且多數(shù)未與臨床表現(xiàn)相結(jié)合。本課題就甲真菌病診斷方法的改良及其致病菌的毒力相關(guān)因子展開研究，包括以下四部分內(nèi)容：第一部分甲真菌病臨床診斷指征的初步探討目的對(duì)甲真菌病的臨床特征進(jìn)行深入研究，以期發(fā)現(xiàn)該病及其致病菌臨床診斷的指征，作為實(shí)驗(yàn)室檢查和流行病學(xué)調(diào)查的輔助方法。方法收集甲真菌病及非甲真菌病病例，

2、詳細(xì)記錄患者的一般情況、病史及病甲特征，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果1.共收集124例甲真菌病和29例其它甲病病例，培養(yǎng)陽(yáng)性者中75例為紅色毛癬菌，6例念珠菌，1例尖孢鐮刀菌，1例厚皮馬拉色菌，1例白念珠菌+紅色毛癬菌。2.有6項(xiàng)病史(手足多汗史，淺部真菌病病史，密切接觸者中有淺部真菌病患者，掌跖脫屑史，趾指間浸漬糜爛史，掌跖/趾指腹水皰史)和2項(xiàng)體征(掌跖脫屑，單側(cè)指甲受累)高度提示甲真菌?。?.與紅色毛癬菌相比，指甲尤其是右側(cè)指甲受累

3、及甲分離高度提示念珠菌感染。結(jié)論甲真菌病有某些特征可作為診斷線索，臨床指征的最終確立尚有待多中心、大樣本、涵蓋不同人群、包括不同致病菌的流行病學(xué)調(diào)查。 第二部分甲真菌病診斷培養(yǎng)基的改良研究第一章改良皮膚癬菌試驗(yàn)培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)研究目的對(duì)DTM培養(yǎng)基作適當(dāng)改進(jìn)，篩選出最佳配方，有利于甲真菌病等淺部真菌病的快速診斷和治療方案的制定。方法1.采用正交設(shè)計(jì)法和單因素分組試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基的主要影響因子進(jìn)行量和質(zhì)的優(yōu)化組合，篩選出改良培養(yǎng)基。2.將

4、紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液倍比稀釋，接種于DTM和改良培養(yǎng)基上，測(cè)定檢出靈敏度。3.將3屬18種皮膚癬菌和11屬14種非皮膚癬菌的絲狀真菌接種于DTM和改良培養(yǎng)基上，比較特異性。結(jié)果1.培養(yǎng)基的氮源，碳源，pH值和指示劑的調(diào)整對(duì)變色時(shí)間的影響無顯著性差異(P＞0.05)，從經(jīng)濟(jì)和早期判斷顏色是否改變的難易程度考慮，確定改良培養(yǎng)基主要配方：0.5％大豆蛋白胨，0.5％葡萄糖，指示劑為溴百里酚藍(lán)(bromothymolblue，BTB)；2.

5、DTM和改良培養(yǎng)基的檢出靈敏度均為103cfu/mL(2×10cfu/培養(yǎng)基)；3.所有受試的皮膚癬菌均能使兩種培養(yǎng)基變色，相對(duì)變色時(shí)間tr(開始變色時(shí)間—開始生長(zhǎng)時(shí)間)DTM為-2d～0d，改良培養(yǎng)基為-4d～0d；絕大多數(shù)受試的非皮膚癬菌的絲狀菌也能使兩種培養(yǎng)基變色，trDTM為1d～5d，改良培養(yǎng)基為1d～6d。結(jié)論改良培養(yǎng)基的配方比DTM經(jīng)濟(jì)，較DTM更易觀察到早期顏色的改變。 第二章改良皮膚癬菌試驗(yàn)培養(yǎng)基(DTM)的臨

6、床研究目的將改良DTM培養(yǎng)基應(yīng)用于甲真菌病臨床標(biāo)本的檢測(cè)，并與原DTM培養(yǎng)基比較，以評(píng)價(jià)其臨床實(shí)用性。方法收集臨床擬診或欲排除甲病的標(biāo)本，分別接種于改良DTM、DTM、SCCA和SCA培養(yǎng)基；記錄菌株的開始生長(zhǎng)時(shí)間、開始變色時(shí)間及開始變色時(shí)菌落的直徑。以專業(yè)真菌實(shí)驗(yàn)室的鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，將DTM和改良DTM報(bào)告的結(jié)果與之比較。結(jié)果1.改良DTM、DTM、SCCA的分離率、菌株的生長(zhǎng)速度及形態(tài)無顯著差異；2.所有分離的皮膚癬菌均能使兩種顯

7、色培養(yǎng)基變色，改良DTM的開始變色時(shí)間(5.83±0.39d)早于DTM(7.32±0.41d)；3.大多數(shù)分離的非皮膚癬菌也能使兩種培養(yǎng)基變色，以開始變色時(shí)菌落的直徑大小為皮膚癬菌和非皮膚癬菌的鑒別點(diǎn)與金標(biāo)準(zhǔn)有高度的一致性。結(jié)論DTM和改良DTM比傳統(tǒng)的鑒定方法結(jié)果報(bào)告時(shí)間提前1周左右，改良培養(yǎng)基的配方較DTM經(jīng)濟(jì)，肉眼觀察其開始變色時(shí)間早于DTM，值得進(jìn)一步地深入研究。 第三部分PCR快速診斷甲真菌病的研究第一章PCR快速診

8、斷淺部真菌病目的初步評(píng)價(jià)應(yīng)用PCR技術(shù)直接從臨床標(biāo)本中檢測(cè)淺部真菌病病原真菌的方法。方法采用蛋白酶K消化法和煮沸法處理臨床標(biāo)本，從中提取致病菌DNA，然后用真菌通用引物ITS1進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，并與直接鏡檢和培養(yǎng)法作對(duì)比。結(jié)果共收集112例臨床標(biāo)本，PCR檢測(cè)、直接鏡檢和培養(yǎng)的敏感度分別為80.7％、96.5％和70.2％，特異度分別為100％、89.1％和100％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為100％、90.2％和100％，陰性預(yù)測(cè)值分別為83

9、.3％、96.1％和76.4％。PCR方法在24h內(nèi)即可完成從標(biāo)本處理至結(jié)果判讀的全過程。結(jié)論P(yáng)CR檢測(cè)具有較好的特異性和準(zhǔn)確性，且比培養(yǎng)法縮短了近2w的時(shí)間，為臨床快速診斷和及時(shí)、合理地治療淺部真菌病提供參考。 第二章多重PCR診斷甲真菌病的實(shí)驗(yàn)研究目的初步建立多重PCR診斷甲真菌病的方法。方法選擇3對(duì)引物(真菌通用引物，皮膚癬菌特異性引物和酵母特異性引物)建立3重PCR體系，采用紅色毛癬菌、白念珠菌和短帚霉摸索反應(yīng)條件和驗(yàn)證

10、體系的適用性；并用紅色毛癬菌來測(cè)定反應(yīng)的靈敏度。結(jié)果1.篩選得到的真菌通用引物NS、皮膚癬菌特異性引物CHS1和酵母特異性引物ACT1有較好的通用性和特異性；2.在適宜的反應(yīng)條件下，無論對(duì)單模板，還是多模板，該反應(yīng)體系均能擴(kuò)增出目的片段，未見明顯非特異片段的干擾；3.該反應(yīng)體系的檢測(cè)靈敏度為102cfu/mL。結(jié)論多重PCR技術(shù)可在較短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出皮膚癬菌，酵母和非皮膚癬菌的絲狀菌等三類病原菌，結(jié)果直觀易讀，其實(shí)用性尚有待于在臨床標(biāo)本的

11、檢測(cè)中驗(yàn)證。 第三章多重PCR快速診斷甲真菌病的臨床研究目的初步評(píng)價(jià)應(yīng)用多重PCR技術(shù)直接從臨床標(biāo)本中檢測(cè)甲真菌病病原真菌的方法。方法采用蛋白酶K消化法和煮沸法處理臨床標(biāo)本，從中提取致病菌DNA，然后用真菌通用引物NS，皮膚癬菌特異性引物CHS1和酵母特異性引物ACT1同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，并與直接鏡檢和培養(yǎng)法作對(duì)比。結(jié)果共收集104例臨床標(biāo)本，PCR檢測(cè)、直接鏡檢和培養(yǎng)的敏感度分別為93.3％、100％和64.4％，特異度分

12、別為100％、86.4％和100％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為100％、84.9％和100％，陰性預(yù)測(cè)值分別為95.2％、100％和78.74％。PCR方法在24h內(nèi)即可完成從標(biāo)本處理至結(jié)果判讀的全過程。結(jié)論多重PCR檢測(cè)具有較好的特異性和準(zhǔn)確性，可初步將甲真菌病的三大類病原菌區(qū)分開，且比培養(yǎng)縮短了近2w的時(shí)間，可為臨床快速診斷和及時(shí)、合理地治療甲真菌病提供參考。 第四章多重RT-PCR診斷甲真菌病的實(shí)驗(yàn)研究目的初步建立多重RT-PCR診

13、斷甲真菌病的方法。方法采用Trizol提取真菌的RNA；選擇3對(duì)引物(真菌通用引物，皮膚癬菌特異性引物和酵母特異性引物)建立3重RT-PCR體系，采用紅色毛癬菌、白念珠菌和短帚霉摸索反應(yīng)條件和驗(yàn)證體系的適用性；并用紅色毛癬菌來測(cè)定反應(yīng)的靈敏度。結(jié)果1.所采用的真菌通用引物28SrDNA、皮膚癬菌特異性引物ACT和酵母特異性引物ACT1有較好的通用性和特異性；2.在適宜的反應(yīng)條件下，無論對(duì)單模板，還是多模板，該反應(yīng)體系均能擴(kuò)增出目的片段，

14、未見明顯非特異片段的干擾；3.該反應(yīng)體系對(duì)模擬臨床標(biāo)本的檢測(cè)靈敏度為102cfu/ml。結(jié)論多重RT-PCR技術(shù)可在較短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出皮膚癬菌，酵母和非皮膚癬菌的絲狀菌等三類病原菌，并可衡量菌的活力，有利于判斷甲組織是否存在真菌的感染。 第四部分甲真菌病致病菌毒力相關(guān)因子的體外研究第一章甲真菌病分離菌株體外角蛋白酶活性的測(cè)定目的對(duì)甲真菌病常見致病菌及污染菌進(jìn)行體外降解角蛋白能力的比較，以初步探討該病的臨床表現(xiàn)與角蛋白酶的相關(guān)性，為

15、該病發(fā)病機(jī)制及治療新途徑的研究提供參考。方法角蛋白酶的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含甲或大豆蛋白胨的培養(yǎng)基，測(cè)定的底物為keratin-azure，以A595nm值衡量角蛋白酶的活性。結(jié)果1.來自兩種誘導(dǎo)培養(yǎng)基的菌株的角蛋白酶活性無顯著性差異；2.皮膚癬菌與非皮膚癬菌的角蛋白酶活性無顯著性差異；3.紅色毛癬菌角蛋白酶活性顯著高于其他受試真菌；4.不同SCIO積分段的甲真菌病紅色毛癬菌臨床分離株角蛋白酶活性的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論甲真菌病的發(fā)病與角蛋白酶

16、有一定相關(guān)性，但僅用角蛋白酶尚不能完全解釋該病的發(fā)病機(jī)制。 第二章甲真菌病分離菌株細(xì)胞外水解酶活性的測(cè)定目的對(duì)甲真菌病常見致病菌及污染菌進(jìn)行細(xì)胞外水解酶活性的測(cè)定，以期發(fā)現(xiàn)可能與該病相關(guān)的毒力因子。方法誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含甲或大豆蛋白胨的培養(yǎng)基，細(xì)胞外水解酶譜的測(cè)定體系采用APIZYM。結(jié)果1.與1％大豆蛋白胨培養(yǎng)基相比，受試的參照菌株在含甲培養(yǎng)基中有3種酶(Phosphataseacid，Naphthol-AS-BI-phospho

17、hydrolase，β-glucuronidase)的活性增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2.與非皮膚癬菌相比，來自于含甲培養(yǎng)基的皮膚癬菌有4種酶活性的增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：Esterase(C4)，EsteraseLipase(C8)，N-acetyl-β-glucosaminidase，a-mannosidase；3.與非紅色毛癬菌相比，來自于含甲培養(yǎng)基的紅色毛癬菌有1種酶(N-acetyl-β-glucosaminidase)活性的升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義