FSH對子宮內(nèi)膜的影響和調(diào)控機(jī)制.pdf

1、本文分析了FSH對子宮內(nèi)膜的影響和調(diào)控機(jī)制。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：FSH促排卵對人子宮內(nèi)膜AQPs和容受因子的影響。
　　 目的：驗(yàn)證FSHR在人子宮內(nèi)膜組織和內(nèi)膜細(xì)胞系Ishikawa細(xì)胞的表達(dá)，探討FSH促排卵對人子宮內(nèi)膜形態(tài)、FSHR、AQPs和內(nèi)膜容受因子表達(dá)的影響。
　　 方法：收集促排卵(COS)婦女著床窗期子宮內(nèi)膜15例、同期對照內(nèi)膜40例，采用化學(xué)發(fā)光法檢測血清FSH和E2水平；采

2、用RT-PCR產(chǎn)物純化克隆測序、蛋白免疫印記、免疫組織化學(xué)、細(xì)胞免疫熒光等方法全面驗(yàn)證人子宮內(nèi)膜組織和細(xì)胞FSHR的表達(dá)。電鏡觀察兩組子宮內(nèi)膜形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)；蛋白免疫印記方法檢測兩組子宮內(nèi)膜FSHR、水通道蛋白(AQP1、AQP2、AQP8)、內(nèi)膜容受因子(Integrinβ3、LIF)、細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白(Claudin4)的表達(dá)與改變。
　　 結(jié)果：人子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜細(xì)胞系Ishikawa細(xì)胞表達(dá)FSHR mRNA和

3、蛋白，RT-PCR產(chǎn)物序列與NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對吻合率100％；蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿COS婦女血清FSH和E2水平顯著高于對照組。掃描電鏡下見對照組內(nèi)膜腔上皮排列有序、胞飲突形成，COS組內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞排列分布紊亂、未見明顯胞飲突；透視電鏡見COS組內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞緊密連接未見明顯改變。COS組內(nèi)膜組織FSHR蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，AQP1、AQP2、AQP8、Integrinβ3、LIF蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Cl

4、audin4表達(dá)無顯著改變。
　　 結(jié)論：FSHR表達(dá)于人子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜細(xì)胞系Ishikawa細(xì)胞。促排卵婦女血清FSH和E顯著升高，內(nèi)膜FSHR表達(dá)上調(diào)、AQP1、AQP2、AQP8、Integrinβ3、LIF蛋白表達(dá)下調(diào)，并致內(nèi)膜腔上皮形態(tài)改變、凋亡增加。FSH可能通過FSHR直接調(diào)節(jié)育齡期子宮內(nèi)膜形態(tài)和功能。
　　 第二部分：FSH影響育齡期子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控機(jī)制。
　　 目的：以動物模型和體外

5、模型為基礎(chǔ)，研究FSH對育齡期子宮內(nèi)膜容受性、胚胎著床的影響及可能機(jī)制。
　　 方法：建立FSH促排卵小鼠動物模型，檢測外源性FSH刺激對小鼠血FSH/E2水平、子宮內(nèi)膜AQPs和著床容受因子、妊娠率和活產(chǎn)率的影響，創(chuàng)新性建立小鼠囊胚粘附模型、檢測FSH/E2、PCMB(AQP抑制劑)預(yù)處理子宮內(nèi)膜細(xì)胞對囊胚粘附著床的影響；同時(shí)進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，采用RT-Real time PCR檢測FSH/E2對AQPs、integrinβ3

6、、LIF等容受因子目的基因表達(dá)水平；采用ssiRNA干擾技術(shù)和JAr滋養(yǎng)細(xì)胞球粘附模型，檢測AQP2/AQP8siRNA干擾后內(nèi)膜容受因子的表達(dá)改變和JAr滋養(yǎng)細(xì)胞球粘附率的改變。
　　 結(jié)果：FSH促排卵組小鼠血FSH/E2水平顯著增高，內(nèi)膜AQP3、AQP2蛋白表達(dá)呈下調(diào)趨勢、FSHR呈微弱上調(diào)趨勢，妊娠率和活產(chǎn)率顯著低于對照組。小鼠囊胚粘附模型實(shí)驗(yàn)顯示，體外FSH、FSH/E及PCMB預(yù)處理子宮內(nèi)膜細(xì)胞均導(dǎo)致囊胚48h和7

7、2h粘附率顯著下降。E2對IK細(xì)胞AQP2和AQP8 mRNA呈濃度依賴性上調(diào)作用，F(xiàn)SH(1、1、3、10、30 IU/L)對IK細(xì)胞AQP2、AQP8和LIF mRNA呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性下調(diào)作用，其中以10IU/L和30IU/L濃度FSH在作用48hr時(shí)的下調(diào)作用最為顯著。AQP2siRNA干擾后lK細(xì)胞著床因子LIF和Integrinβ3表達(dá)顯著下調(diào)，OLFM1表達(dá)顯著上調(diào)；AQP8siRNA干擾后LIF表達(dá)顯著下調(diào)，OLF

8、M1表達(dá)顯著上調(diào)。子宮內(nèi)膜細(xì)胞AQP8siRNA和AQP2siRNA干擾后，JAr滋養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)粘附率均顯著下降。
　　 結(jié)論：超生理水平FSH通過下調(diào)育齡期子宮內(nèi)膜AQPs、干擾內(nèi)膜容受因子表達(dá)，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜對胚胎的容受性、不利于胚胎著床。
　　 第三部分：長期高FSH刺激對圍絕經(jīng)期子宮內(nèi)膜萎縮的影響。
　　 目的：通過在體組織、動物模型和體外細(xì)胞模型，探討絕經(jīng)后高FSH水平在子宮內(nèi)膜功能及萎縮中所起的作用及其

9、機(jī)制。
　　 方法：采用化學(xué)發(fā)光法檢測圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后不同年齡段婦女血清FSH、LH、E2變化動態(tài)，免疫組織化學(xué)方法檢測絕經(jīng)后婦女和育齡期婦女子宮內(nèi)膜FSHR、Ki67、AQP1、AQP2、AQP8蛋白表達(dá)。采用MTF法檢測FSH對人原代培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和Ishikawa細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀檢測FSH對Ishikawa細(xì)胞周期的影響，Real time PCR檢測高濃度FSH對子宮內(nèi)膜細(xì)胞AQP2和AQP8表達(dá)的影響

10、、并檢測AC激動劑和拮抗劑對FSH作用的影響。建立手術(shù)去勢動物模型、藥物去勢動物模型和假手術(shù)(對照)動物模型，通過RIA方法檢測血FSH和E2水平，采用透視電鏡觀察子宮內(nèi)膜細(xì)胞形態(tài)和凋亡指征、Westernblotting檢測子宮內(nèi)膜增殖和凋亡相關(guān)指標(biāo)。
　　 結(jié)果：絕經(jīng)后婦女血清FSH水平隨年齡從41-50歲年齡段到61-70年齡段呈逐步上升，從61-70年齡段到71-80年齡段無顯著上升。血清E2水平呈現(xiàn)與FSH同步的反向變

11、化。與育齡期內(nèi)膜相比，絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜FSHR、AQP2和AQP1蛋白表達(dá)無顯著改變，Ki67表達(dá)顯著下降，AQP8蛋白間質(zhì)表達(dá)較育齡期增高、腺體表達(dá)較育齡期降低。FSH對原代子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞呈濃度依賴性的抑制增殖作用，但對Ishikawa細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期無明顯影響。高濃度FSH(50IU/L、100IU/L、200IU/L、400IU/L)呈濃度依賴性顯著上調(diào)Ishikawa細(xì)胞AQP2 mRNA的表達(dá)，該上調(diào)作用可部分被SQ225

12、36所拮抗。Forskolin可上調(diào)Ishikawa細(xì)胞AQP2 mRNA的表達(dá)。動物模型實(shí)驗(yàn)方面，成功建立了手術(shù)去勢(OVX，高FSH、低E2)、藥物去勢(GnRHa，低FSH、低E2)和假手術(shù)對照組(SHAM，F(xiàn)SH和E2水平如常)小鼠。OVX組小鼠子宮萎縮明顯、透視電鏡下見大片凋亡細(xì)胞和散在凋亡小體，而GnRHa組小鼠子宮大小、萎縮度及細(xì)胞凋亡現(xiàn)象介于SHAM組和OVX組之間。與SHAM組相比，GnRHa組小鼠子宮C-FOS、C-