二氮嗪對(duì)窒息新生大鼠心肌線粒體保護(hù)作用機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　新生兒窒息如未及時(shí)救治可引起各器官系統(tǒng)缺氧缺血損傷,而復(fù)蘇后又可導(dǎo)致再灌注損傷,其中心臟、腦等器官對(duì)缺氧缺血/再灌注損傷較敏感,多種機(jī)制參與該過(guò)程。線粒體是細(xì)胞“能量工廠”,通過(guò)氧化磷酸化作用產(chǎn)生細(xì)胞生存所需90％的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)。近年來(lái),人們對(duì)凋亡的認(rèn)識(shí)已逐漸由細(xì)胞核為中心的調(diào)控模式轉(zhuǎn)變?yōu)橐跃€粒體為中心的調(diào)控模式,多種損傷機(jī)制最終通過(guò)影響線粒體功能導(dǎo)致心肌細(xì)胞

2、凋亡或壞死,而線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)開放是缺血/再灌注導(dǎo)致線粒體損傷并最終致細(xì)胞死亡的關(guān)鍵性事件。近年研究發(fā)現(xiàn),線粒體ATP敏感性鉀離子通道(mitochodrial ATP-sensitiveK+channels,mitoKATP)開放對(duì)多種組織細(xì)胞缺氧缺血損傷有保護(hù)作用,參與了缺血預(yù)適應(yīng)和缺血后適應(yīng)心肌保護(hù)作用。對(duì)mitoKATP通道的深入

3、研究發(fā)現(xiàn),該通道與MPTP之間存在密切關(guān)系,但其相互作用機(jī)制仍未完全闡明。
　　本研究以窒息誘發(fā)心肌缺氧缺血損傷的新生大鼠為研究對(duì)象,觀察心肌損傷程度、心肌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor,AIF)表達(dá)量,檢測(cè)心肌MPTP開放度、線粒體膜電位(ψm)變化、線粒體活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成量,并觀察以特異性mitoKATP通道開放劑二氮嗪(Diazoxi

4、de)干預(yù)后心肌損傷程度以及線粒體功能的變化,以期闡明窒息新生大鼠心肌細(xì)胞MPTP開放度與心肌損傷之間的關(guān)系、mitoKATP通道開放劑對(duì)窒息后心肌細(xì)胞MPTP開放度的影響,并進(jìn)一步闡述mitoKATP通道開放劑對(duì)缺氧缺血/再灌注損傷后心肌保護(hù)作用機(jī)制,為窒息后心肌損傷的治療提供新策略。
　　方法：
　　成年SpragueDawley(SD)母鼠懷孕第21天行剖宮產(chǎn),隨機(jī)分為正常分娩組及動(dòng)脈夾閉組,正常分娩組不夾閉子宮動(dòng)脈,

5、所分娩新生鼠為對(duì)照組;動(dòng)脈夾閉組孕鼠以?shī)A閉子宮動(dòng)脈方法制作宮內(nèi)窒息新生大鼠模型,再將存活新生大鼠隨機(jī)分為窒息組、二氮嗪組、格列苯脲組、溶劑組。對(duì)照組及窒息組新生鼠出生后不予任何藥物干預(yù),二氮嗪組在出生后腹腔注射mitoKATP通道開放劑二氮嗪3mg/kg,格列苯脲組在出生后腹腔注射二氮嗪3mg/kg及mitoKATP通道抑制劑格列苯脲300g/kg,溶劑組在出生后腹腔注射藥物溶劑0.1mMNaOH0.5ml。每組各30只新生大鼠,于出生

6、24h處死新生大鼠,10只取心臟血以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)方法檢測(cè)血清心肌肌鈣蛋白I(cardiactroponinI,cTnI),心肌組織用于分離線粒體,以熒光分光光度計(jì)檢測(cè)MPTP開放度、線粒體ψm、ROS;10只取心肌組織切片以TTC染色方法檢測(cè)心肌缺血面積;10只取心尖組織制作石蠟切片及超薄切片,以HE染色及電鏡觀察心肌細(xì)胞及線粒體形態(tài)變化、以免疫組化染色方法

7、檢測(cè)心肌組織AIF表達(dá)量。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(sx±)表示,采用SPSSforWindows13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行資料分析。
　　結(jié)果：
　　對(duì)照組、窒息組、二氮嗪組、格列苯脲組、溶劑組新生大鼠血清cTnI分別為0.08±0.04、0.40±0.29、0.10±0.04、0.33±0.17、0.34±0.20(g/L)(P<0.01),窒息組明顯升高,二氮嗪干預(yù)后下降,格列苯脲組、溶劑組與窒息組相近。各組新生大鼠心肌組織切片以

8、TTC染色觀察心肌缺血面積,對(duì)照組、窒息組、二氮嗪組、格列苯脲組、溶劑組新生大鼠心肌缺血面積分別為8.01±3.48、42.50±15.90、14.79±3.98、31.51±20.86、28.37±14.36(%)(P<0.01),窒息組出現(xiàn)心肌點(diǎn)狀壞死,二氮嗪干預(yù)后心肌缺血情況有所好轉(zhuǎn),接近正常組,格列苯脲組、溶劑組與窒息組相近。以HE染色觀察新生大鼠心肌細(xì)胞損傷的病理改變,窒息組心肌細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞腫脹、部分細(xì)胞溶解,二氮嗪干預(yù)

9、后心肌細(xì)胞腫脹有所減輕、排列好轉(zhuǎn),但尚未達(dá)正常,格列苯脲組及溶劑組結(jié)果與窒息組相近,格列苯脲抑制二氮嗪作用,溶劑對(duì)結(jié)果無(wú)影響。電鏡觀察窒息組心肌細(xì)胞核固縮、核崩解,線粒體空泡變性、外膜破裂、內(nèi)膜腫脹,二氮嗪干預(yù)后線粒體空泡變性減少、線粒體腫脹較窒息組好轉(zhuǎn),格列苯脲組及溶劑組與窒息組結(jié)果相近。對(duì)照組、窒息組、二氮嗪組、格列苯脲組、溶劑組新生大鼠心肌組織AIF陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為:9.70±3.06、77.50±11.81、44.60±17.

10、49、70.70±14.36、73.60±15.19(%)(P<0.01),窒息組較正常組明顯升高,二氮嗪組表達(dá)下降,但仍較正常組高,格列苯脲組、溶劑組與窒息組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;對(duì)照組、窒息組、二氮嗪組、格列苯脲組、溶劑組新生大鼠MPTP分別為118.10±19.10、79.40±10.57、106.40±14.61、72.50±11.21、76.20±3.79(RFU)(P<0.01),ψm分別為1.61±0.08、2.01±0.09

11、、1.86±0.15、1.96±0.27、2.10±0.29(RFU)(P<0.01),ROS分別為237.10±53.33、875.30±206.62、308.50±103.12、787.40±261.35、892.00±151.45(RFU)(P<0.01)。窒息組心肌MPTP開放增多、膜電位下降、ROS生成增多,二氮嗪干預(yù)后MPTP開放度降低、ROS生成減少,格列苯脲組以及溶劑組結(jié)果均與窒息組相近;各組新生大鼠血清cTnI水平與心

12、肌MPTP開放度(RFU)的相關(guān)系數(shù)r為-0.384(P<0.01),各組新生大鼠心肌AIF表達(dá)量與心肌MPTP開放度(RFU)的相關(guān)系數(shù)r為-0.725(P<0.01),由于RFU越小提示MPTP開放度越大,cTnI值、AIF值與RFU值呈負(fù)相關(guān),則表示cTnI值、AIF值與MPTP開放度呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.窒息新生大鼠出現(xiàn)心肌損傷,表現(xiàn)為血清cTnI升高、心肌缺血及壞死、AIF表達(dá)增高;并呈現(xiàn)心肌線粒體損傷,

13、表現(xiàn)為心肌線粒體空泡變性、心肌MPTP開放度增大、線粒體膜電位下降、ROS生成增多,cTnI值、AIF值與MPTP開放度呈正相關(guān),提示窒息后心肌MPTP開放度增大是導(dǎo)致心肌損傷的重要原因;
　　2.窒息新生大鼠經(jīng)mitoKATP通道開放劑二氮嗪干預(yù)后,血清cTnI升高程度下降、心肌缺血面積縮小、心肌線粒體形態(tài)改善、AIF表達(dá)下降,提示二氮嗪干預(yù)可保護(hù)心肌線粒體功能,從而減輕窒息后缺氧缺血性心肌損傷;
　　3.窒息新生大鼠經(jīng)二