Hath6調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞分化與功能及其作用機(jī)制研究.pdf

1、內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)移植是治療四肢缺血和心血管疾病的新策略。骨髓來源的單個核細(xì)胞、血液來源的祖細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞都可以作為誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,ECs)的種子細(xì)胞。由于胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)可以在體外條件下模擬胚胎發(fā)育的過程,用于關(guān)鍵信號通路及調(diào)控分子的研究,進(jìn)而受到越來越多的關(guān)注。目前,人胚胎干

2、細(xì)胞(human embryonic stem cells,hESCs)向ECs誘導(dǎo)分化主要有三種策略,即添加生長因子、低氧及層流剪切力(laminar shear stress,LSS)的誘導(dǎo)。大量文獻(xiàn)報道表明添加重組人內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(recombinant human vascular endothelial growth factor,rhVEGF)、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(recombined human basic f

3、ibroblast growth factor,rhbFGF)等生長因子及低氧誘導(dǎo)因子HIF1α可以調(diào)控hESCs向ECs的誘導(dǎo)分化。但是對LSS作用機(jī)制的研究并不是很多。LSS在體內(nèi)條件下,主要是指血液在血管中流動時對血管壁產(chǎn)生的沖擊力。ECs作為襯貼于血管內(nèi)腔面的單層扁平細(xì)胞會響應(yīng)血流的刺激發(fā)揮對血管的調(diào)控作用,包括對血管收縮和舒張的調(diào)節(jié)。ECs對血流刺激的響應(yīng)就是對LSS的響應(yīng)。已經(jīng)有文獻(xiàn)報道表明LSS在促進(jìn)ECs分化及ECs功能

4、調(diào)控過程中都發(fā)揮了重要作用。
　　人atonal同源基因6(human atonal homologue 6,Hath6)是在使用LSS處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)檢測基因表達(dá)變化時被發(fā)現(xiàn)的。LSS處理后,Hath6的表達(dá)明顯上調(diào)。初步的研究結(jié)果表明Hath6是ECs選擇性表達(dá)的堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,

5、bHLH)轉(zhuǎn)錄因子,該轉(zhuǎn)錄因子家族成員在細(xì)胞的分化及胚胎發(fā)育形成中都有重要的調(diào)控作用。不僅如此,Hath6在人類一些高度血管化的組織中高表達(dá),這提示Hath6作為ECs中響應(yīng)LSS的轉(zhuǎn)錄因子,其有可能參與到血管的發(fā)生及調(diào)控中。LSS對ECs的分化及功能調(diào)控有重要作用,Hath6作為ECs中響應(yīng)LSS的轉(zhuǎn)錄因子,這些進(jìn)一步提示Hath6有可能參與到ECs的分化及功能調(diào)控中。
　　為了驗證我們的假設(shè),在本課題中我們模擬LSS處理細(xì)胞,

6、檢測Hath6的表達(dá)變化;進(jìn)一步建立過表達(dá)及下調(diào)表達(dá)Hath6的hESCs及ECs并在此基礎(chǔ)上展開Hath6對ECs分化、功能調(diào)控及其作用機(jī)制的研究。
　　首先,為研究Hath6對ECs誘導(dǎo)分化的影響,我們建立了一套hESCs起始向ECs誘導(dǎo)分化的三階段誘導(dǎo)體系。在分階段誘導(dǎo)分化的過程中,在誘導(dǎo)分化的第二階段檢測到內(nèi)皮相關(guān)表面標(biāo)志——CD31、KDR和VE-cadherin的比例可以分別到達(dá)約16％、60%和10%,進(jìn)一步功能的檢

7、測發(fā)現(xiàn),該誘導(dǎo)分化階段的細(xì)胞可以形成血管樣結(jié)構(gòu),結(jié)合植物凝集素。進(jìn)一步的誘導(dǎo)分化不僅僅可以獲得更大量的細(xì)胞并且所得CD31單陽性細(xì)胞的比例進(jìn)一步提高至30%以上,同時細(xì)胞具備吞噬LDL的能力。上述實(shí)驗結(jié)果表明我們建立了一套二維培養(yǎng)條件下,無血清、成分明確的ECs誘導(dǎo)分化體系,這是我們開展下游研究工作的基礎(chǔ)。
　　其次,我們利用Q-PCR檢測到hESCs自主分化及分階段誘導(dǎo)內(nèi)皮分化的過程中,內(nèi)源性Hath6的表達(dá)呈現(xiàn)明顯上調(diào)的趨勢,

8、與內(nèi)皮特異性基因的上調(diào)表達(dá)呈正相關(guān),這和我們的假設(shè)相一致。之后我們使用建立的過表達(dá)及下調(diào)表達(dá)Hath6的hESCs進(jìn)行ECs的定向誘導(dǎo)分化,觀察Hath6的表達(dá)變化對內(nèi)皮分化的影響。Q-PCR的結(jié)果表明,同對照組相比,Hath6的過表達(dá)明顯上調(diào)了內(nèi)皮相關(guān)基因的表達(dá),基因上調(diào)幅度均超過3倍;流式檢測的結(jié)果表明,Hath6的過表達(dá)促進(jìn)了CD31+、KDR+及CD31+/KDR+細(xì)胞亞群比例,統(tǒng)計分析的數(shù)據(jù)表明Hath6的過表達(dá)顯著提高了上述

9、細(xì)胞亞群比例約1.5倍并且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05);血管樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗的結(jié)果表明,Hath6的過表達(dá)顯著促進(jìn)了血管樣結(jié)構(gòu)的形成及Dil-Ac-LDL的吞噬。這些結(jié)果都表明Hath6的過表達(dá)可以顯著促進(jìn)ECs的分化。在Hath6下調(diào)表達(dá)組的實(shí)驗中,我們檢測到Hath6的下調(diào)表達(dá)明顯抑制了內(nèi)皮相關(guān)基因在mRNA及蛋白水平的表達(dá),也明顯抑制了血管樣結(jié)構(gòu)的形成和Dil-Ac-LDL的吞噬。這些結(jié)果表明Hath6對ECs的分化是必須的。

10、綜上所述,我們認(rèn)為Hath6調(diào)控了ECs的分化。
　　再次,我們對Hath6是否能夠調(diào)控ECs的功能進(jìn)行了驗證。在建立了過表達(dá)及下調(diào)表達(dá)Hath6的ECs后,我們首先通過RT-PCR實(shí)驗檢測到,Hath6的過表達(dá)促進(jìn)了成熟ECs中內(nèi)皮相關(guān)基因的表達(dá),該結(jié)果證明Hath6對其它內(nèi)皮基因的表達(dá)有調(diào)控作用。隨后我們通過血管樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗證實(shí)在成熟的ECs中,Hath6的過表達(dá)并不能夠明顯的促進(jìn)血管樣結(jié)構(gòu)的形成,細(xì)胞增殖實(shí)驗檢測Hath6

11、的過表達(dá)會明顯抑制ECs的增殖。我們又進(jìn)一步驗證Hath6的過表達(dá)對細(xì)胞遷移的影響,結(jié)合Hath6對增殖的明顯抑制作用,認(rèn)為其過表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的遷移。在Hath6下調(diào)表達(dá)組的實(shí)驗中,檢測到Hath6的下調(diào)表達(dá)會抑制內(nèi)皮相關(guān)基因的表達(dá),明顯抑制血管樣結(jié)構(gòu)的形成(p<0.05),促進(jìn)細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞的遷移。這些結(jié)果都表明,Hath6促進(jìn)了ECs的終末成熟。
　　最后,在明確了Hath6對ECs的分化及功能調(diào)控作用后,我們開始思考

12、Hath6的作用機(jī)制。Hath6作為響應(yīng)LSS的轉(zhuǎn)錄因子,可能在響應(yīng)LSS后通過調(diào)控基因的表達(dá)變化實(shí)現(xiàn)其對內(nèi)皮功能的調(diào)控作用。推測作為Hath6下游的靶分子應(yīng)該也會響應(yīng)LSS,進(jìn)一步發(fā)生表達(dá)水平的改變實(shí)現(xiàn)對ECs分化及功能的調(diào)控作用。此外,Hath6屬于堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族成員,該家族成員通常通過結(jié)合靶基因啟動子區(qū)域的E-box序列發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,因此確定啟動子區(qū)域的E-box也成為我們判斷Hath6靶基因的標(biāo)準(zhǔn)之一?；?/p>

13、上述三個特點(diǎn),我們初步篩選eNOS為Hath6的靶基因。有研究表明LSS處理后eNOS表達(dá)上調(diào),并且其通過調(diào)控NO的產(chǎn)生對ECs的分化及功能調(diào)控都重要作用,最關(guān)鍵的一點(diǎn)是生物信息學(xué)的分析數(shù)據(jù)表明,eNOS基因上游啟動子區(qū)域包含大量的E-box序列。因此在本部分的研究中,我們以eNOS為切入點(diǎn)展開Hath6作用機(jī)制的研究。首先我們使用LSS分別處理HUVECs及hESCs,檢測到LSS處理后Hath6和eNOS在mRNA水平的表達(dá)均發(fā)生明

14、顯上調(diào),HUVECs中分別上調(diào)6.2倍(p<0.001)和2.8倍(p<0.01);hESCs中LSS處理8h后,Hath6的mRNA表達(dá)水平上調(diào)了3.6倍(p<0.05),LSS處理20h后上調(diào)至6.1倍(p<0.05),呈現(xiàn)明顯的LSS處理時間依賴效應(yīng)。之后通過Westernblot驗證了上調(diào)及下調(diào)表達(dá)Hath6的ECs及hESCs-ECs誘導(dǎo)分化過程中eNOS的表達(dá)變化是受Hath6調(diào)控的,進(jìn)一步使用eNOS小分子抑制劑——L-N

15、AME驗證在Hath6-hESCs-ECs誘導(dǎo)分化體系中,添加L-NAME會明顯降低由Hath6的過表達(dá)所致的內(nèi)皮誘導(dǎo)分化效率的提高,最后使用LSS處理sh-Hath6-hESCs檢測到同對照組相比,sh-Hath6-hESCs中eNOS的表達(dá)也被明顯下調(diào)(p<0.001),這說明Hath6的下調(diào)表達(dá)降低了eNOS對LSS的響應(yīng)。以上結(jié)果證明,Hath6作為響應(yīng)LSS的轉(zhuǎn)錄因子,通過調(diào)控eNOS的表達(dá)水平進(jìn)一步調(diào)控eNOS信號通路,實(shí)現(xiàn)

16、其對ECs誘導(dǎo)分化及功能的調(diào)控作用。
　　綜上所述,Hath6的過表達(dá)對以hESCs為起始向ECs的誘導(dǎo)分化有明顯的促進(jìn)作用,其下調(diào)表達(dá)會明顯抑制該過程的發(fā)生;在成熟的ECs中,Hath6可以調(diào)控ECs的功能;進(jìn)一步作用機(jī)制的研究結(jié)果表明,Hath6作為轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控eNOS的表達(dá)進(jìn)而活化下游信號通路,實(shí)現(xiàn)其對ECs分化及功能的調(diào)控。當(dāng)前,對LSS調(diào)控內(nèi)皮分化及功能的作用機(jī)理研究的并不透徹,而對Hath6的研究為進(jìn)一步深入理解L