Wnt拮抗劑SFRP1在胃腸道腫瘤發(fā)病機制中的作用.pdf

1、本文將進一步探討分泌型frizzled相關(guān)蛋白1(SFRP1)表達下調(diào)與胃腸道腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲能力之間的相關(guān)性。通過檢測MMP-2和MMP-9水平，探討其具體機制。 研究材料與方法： 1、研究材料： 胃癌及相應(yīng)的癌旁組織各52例，結(jié)直腸癌及相應(yīng)的癌旁組織各60例，均來自于中國醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院。標本獲取后即冷凍于液氮之中。人類胃癌細胞系SGC-7901，BGC-823和HGC-27，結(jié)腸癌細胞系HT-29和SW-4

2、80均購自上海昆肯生物化工有限公司。Trizol試劑、RNA PCR試劑盒和LightCycler DNA MasterSYBR Green I試劑盒，購自于寶生物公司。GENMED基因甲基化檢測試劑盒購自于上海杰美公司。SFRP1、MMP-2和MMP-9多克隆抗體購自于美國SANTACRUZ公司。 2、研究方法： 人類胃癌細胞系SGC-7901、BGC-823、HGC-27，結(jié)腸癌細胞系HT-29和SW-480均培養(yǎng)于

3、RPMI 1640中，添加10％肽牛血清，青霉素(100IU/ml)及鏈霉素(100μg/ml)。采用飽和氯化鈉法進行DNA提取。采用Trizol法進行RNA提取。采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)進行SFRP1 mRNA定性檢測。采用即時定量PCR檢測MMP-2和MMP-9mRNA表達。采用甲基化特異性PCR(MsP)檢測SFRP1基因甲基化狀態(tài)。采用Western blotting檢測MMP-2和MMP-9蛋白表達。 3、統(tǒng)計

4、學分析腫瘤組織與癌旁組織比較采用卡方檢驗；腫瘤細胞之間的比較采用t檢驗；SFRP1表達與患者臨床病理特征之間的相關(guān)性分析采用Fisher’s精確檢驗。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。 研究結(jié)果： 1、胃癌細胞系SFRP1甲基化狀態(tài)及表達狀態(tài)胃癌細胞BGC-823和HGC-27存在SFRP1基因甲基化，而SGC-7901未檢出SFRPl基因甲基化。SGC-7901存在SFRP1 mRNA表達，而BGC-823和HGC-27未檢

5、出表達。采用去甲基化試劑5-氮雜-脫氧胞苷酸(5-aza-2’-deoxycytidine)對BGC-823和HGC-27進行處理后，SFRP1 mRNA重新出現(xiàn)表達。 2、胃癌標本及癌旁組織中SFRPl甲基化狀態(tài)及表達狀態(tài)在52例胃癌中，23例存在SFRP1基因甲基化現(xiàn)象。在其相應(yīng)的癌旁組織中，8例檢出SFRPl甲基化，兩者差異顯著(P<0.01)。17例胃癌存在SFRP1表達消失。在其相應(yīng)的癌旁組織中，6例表達消失，兩者差異

6、顯著(P<0.01)。SFRP1表達消失與SFRP1基因甲基化具有顯著相關(guān)性(P<0.001)。 3、結(jié)腸癌細胞系SFRP1甲基化狀態(tài)及表達狀態(tài)結(jié)腸癌細胞SW-480檢出SFRP1基因甲基化，而HT-29未檢出SFRP1基因甲基化。HT-29存在SFRP1 mRNA表達，而SW-480未檢出表達。采用去甲基化試劑5-氮雜-脫氧胞苷酸對SW-480進行處理后，SFRP1 mRNA重新出現(xiàn)表達。 4、結(jié)腸癌標本及癌旁組織中S

7、FRP1甲基化狀態(tài)及表達狀態(tài)在60例結(jié)直腸癌中，38例存在SFRP1基因甲基化現(xiàn)象。在其相應(yīng)的癌旁組織中，11例檢出SFRP1甲基化，兩者差異顯著(P<0.01)。35例結(jié)直腸癌存在SFRP1表達消失。在其相應(yīng)的癌旁組織中，8例表達消失，兩者差異顯著(P<0.01)。SFRP1表達消失與SFRP1基因甲基化具有顯著相關(guān)性(P<0.001)。 5、SFRP1表達消失與胃癌、結(jié)腸癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性SFRP1表達消失與胃癌

8、患者年齡、性別、腫瘤大小及組織類型均無相關(guān)性，而與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況具有相關(guān)性。SFRP1表達消失與結(jié)直腸患者年齡、性別、腫瘤大小均無相關(guān)性，而與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況具有相關(guān)性。 6、胃癌和結(jié)腸癌細胞系MMP-2和MMP-9 mRNA表達在胃癌細胞系中，SGC-7901表達低水平MMP-2和MMP-9 mRNA，而BGC-823表達高水平MMP-2和MMP-9 mRNA，兩者差異顯著(P<0.01))。在結(jié)腸癌細胞系中

9、，HT-29表達低水平的MMP-2和MMP-9 mRNA，而SW-480表達高水平MMP-2和MMP-9 mRNA，兩者差異顯著(P<0.01))。 7、胃癌和結(jié)腸癌細胞系MMP-2和MMP-9蛋白表達在胃癌細胞系中，SGC-7901表達低水平MMP-2和MMP-9蛋白，而BGC-27表達高水平的MMP-2和MMP-9蛋白。結(jié)腸癌細胞系中HT-29表達低水平MMP-2和MMP-9蛋白，而SW-480表達高水平的MMP-2和MMP

10、-9蛋白。 8、胃癌和結(jié)腸癌細胞系經(jīng)去甲基化處理后檢測采用去甲基化試劑5-氮雜-脫氧胞苷酸處理胃癌細胞系BGC-27和結(jié)腸癌細胞系SW480后，發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9 mRNA水平均較處理前顯著降低(P<0.01)． 研究結(jié)論： (1)SFRP1在部分胃癌中表達消失，其機制主要由SFRP1基因甲基化所致。結(jié)果提示，SFRP1表達消失與部分胃癌發(fā)病有關(guān)。 (2)SFRP1在部分結(jié)直腸癌中表達消失，且其機