皮質(zhì)醇調(diào)控人胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞芳香化酶表達(dá)的分子機(jī)制.pdf

1、目的及方法：
　　本研究以人胎盤(pán)組織及胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞為研究模型，采用免疫組織化學(xué)染色、體外胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)、蛋白印跡雜交（Western blotting）、酶聯(lián)免疫測(cè)定(Enzymeimmunoassay，EIA)、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染、啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因活性測(cè)定、化學(xué)發(fā)光微

2、粒子免疫法(ChemiluminescentMicroparticle immunoassay，CMIA)以及染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation，ChIP)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，聯(lián)合類固醇激素及其受體拮抗劑、信號(hào)通路激動(dòng)劑及其拮抗劑和轉(zhuǎn)錄因子抑制劑等工具藥，研究了糖皮質(zhì)激素對(duì)人類胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞芳香化酶的表達(dá)調(diào)控作用及其分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.人胎盤(pán)組織的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，芳香

3、化酶主要在胎盤(pán)絨毛小葉的合體滋養(yǎng)層中大量表達(dá)，而絨毛小葉的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和胎兒血管幾乎無(wú)表達(dá)。此外，通過(guò)qRT-PCR和Western blotting的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，芳香化酶的mRNA和蛋白水平隨著細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞向合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化而不斷增加。
　　2.qRT-PCR和Western blotting測(cè)定結(jié)果表明，皮質(zhì)醇（0.01-1μM，24h）能夠劑量依賴性誘導(dǎo)人胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞芳香化酶mRNA和蛋白的表達(dá)。而且，

4、EIA的測(cè)定結(jié)果表明，皮質(zhì)醇(1μM，24h)也可以誘導(dǎo)胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中DHEA向雌二醇的轉(zhuǎn)化。
　　3.免疫組織化學(xué)、普通PCR以及Western blotting的實(shí)驗(yàn)表明，人胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)大量的糖皮質(zhì)激素受體(GR);在此基礎(chǔ)上，我們采用qRT-PCR、Western blotting以及GR siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞等實(shí)驗(yàn)方法研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇(0.1μM，24h)對(duì)人胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞芳香化酶mRNA和蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)

5、作用能夠被GR拮抗劑RU486(1μM)和GR siRNA(120 nM)阻斷;此外，皮質(zhì)醇對(duì)芳香化酶mRNA的誘導(dǎo)作用可以被蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮CHX(10μM)阻斷，這些結(jié)果提示皮質(zhì)醇對(duì)人胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞芳香化酶mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)作用需要GR參與介導(dǎo)，但此介導(dǎo)作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)其它蛋白合成間接實(shí)現(xiàn)的。
　　4.qRT-PCR和Western blotting的檢測(cè)結(jié)果表明，cAMP的類似物db-cAMP(100μM，24

6、h)和腺苷酸環(huán)化酶的激動(dòng)劑Forskolin(100μM，24h)都能夠顯著促進(jìn)胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞芳香化酶的表達(dá);此外，我們利用EIA方法測(cè)定胞內(nèi)cAMP水平發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇(1μM，12h)可以顯著增加胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的胞內(nèi)cAMP水平;進(jìn)一步研究顯示，PKA的抑制劑H89(10μM)以及Gαs的抑制劑NF449(20μM)均可以阻斷皮質(zhì)醇(1μM，24h)對(duì)胎盤(pán)芳香化酶表達(dá)的誘導(dǎo)作用。這些結(jié)果提示，皮質(zhì)醇對(duì)胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中芳香化酶

7、的表達(dá)調(diào)控是間接通過(guò)cAMP/PKA信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　5.眾所周知，糖皮質(zhì)激素的經(jīng)典作用需要通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的GR受體介導(dǎo)，于是我們推測(cè)在胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中，糖皮質(zhì)激素很可能通過(guò)GR誘導(dǎo)了與cAMP/PKA信號(hào)通路激活相關(guān)的激素的合成與分泌從而來(lái)促進(jìn)胎盤(pán)芳香化酶的表達(dá)和雌激素的合成。已有報(bào)道，皮質(zhì)醇可以通過(guò)GR誘導(dǎo)胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞CRH和hCG的表達(dá)與分泌，并且CRH和hCG的受體都能激活cAMP/PKA信號(hào)通路。因此，我們對(duì)C

8、RH和hCG是否參與了皮質(zhì)醇對(duì)人胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞芳香化酶的表達(dá)調(diào)控作用進(jìn)行了研究。通過(guò)qRT-PCR測(cè)定發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇(0.01-1μM，12h)可以劑量依賴性的誘導(dǎo)胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞CRH和hCGα與β亞基的表達(dá)，進(jìn)一步用EIA和CMIA測(cè)定發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇(1μM)處理胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞12小時(shí)后就可以顯著增加胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞CRH和hCG的分泌，且該作用可以一直持續(xù)到24小時(shí)。而且，qRT-PCR、Western blotting以

9、及EIA測(cè)定結(jié)果表明，CRH受體的非選擇性拮抗劑α-h-CPH(1μM)和hCG抗體(1∶100)單獨(dú)都可以部分阻斷皮質(zhì)醇(1μM)對(duì)胞內(nèi)cAMP水平和芳香化酶表達(dá)的誘導(dǎo)作用;當(dāng)這兩者聯(lián)合用藥時(shí)，則不僅可以降低胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞胞內(nèi)cAMP的基礎(chǔ)水平和芳香化酶的基礎(chǔ)表達(dá)，還能進(jìn)一步完全阻斷皮質(zhì)醇對(duì)cAMP水平和芳香化酶表達(dá)的誘導(dǎo)作用。這些結(jié)果提示CRH和hCG不僅通過(guò)cAMP/PKA信號(hào)通路共同維持著胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞芳香化酶的基礎(chǔ)表達(dá)

10、，而且還介導(dǎo)了皮質(zhì)醇對(duì)胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞芳香化酶的誘導(dǎo)作用。
　　6.由于胎盤(pán)芳香化酶基因可以利用不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，因此我們通過(guò)設(shè)計(jì)識(shí)別不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特異引物進(jìn)行PCR，研究發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞主要表達(dá)芳香化酶基因啟動(dòng)子PI.1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并伴有少量啟動(dòng)子PI.2和P2a的表達(dá)產(chǎn)物，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果還表明皮質(zhì)醇(1μM，24h)對(duì)包含芳香化酶基因外顯子Ⅰ.1和包含外顯子2a的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有誘導(dǎo)作用，而對(duì)包含芳香化

11、酶基因外顯子Ⅰ.2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物則無(wú)作用;此外，熒光素酶報(bào)告基因活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇(1μM，24h)和Forskolin(100μM，24h)都可以顯著誘導(dǎo)胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞芳香化酶基因-501bp啟動(dòng)子PI.1的活性，這說(shuō)明皮質(zhì)醇通過(guò)作用于芳香化酶基因啟動(dòng)子PI.1誘導(dǎo)了胎盤(pán)芳香化酶的表達(dá)。
　　7.我們對(duì)芳香化酶基因啟動(dòng)子PI.1序列生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，此序列上具有多個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)，因此進(jìn)一步研究了Sp1在胎盤(pán)芳香化酶表達(dá)調(diào)

12、控中的作用。用qRT-PCR和Western blotting的方法研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇(1μM)、db-cAMP(100μM)和Forskolin(100μM)處理細(xì)胞24h后都能夠顯著誘導(dǎo)胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞Sp1的表達(dá)，且皮質(zhì)醇對(duì)Sp1的誘導(dǎo)作用也可以被H89以及NF449所阻斷;此外，Sp1的拮抗劑光神霉素A（Mythramycin A，M，50μM）和Sp1的siRNA(60 nM)不僅能夠抑制胎盤(pán)芳香化酶的基礎(chǔ)表達(dá)，而且還能夠抑制

13、皮質(zhì)醇和Forskolin對(duì)芳香化酶表達(dá)的促進(jìn)作用。進(jìn)一步用ChIP方法研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇(1μM)以及db-cAMP(100μM)和Forskolin(100μM)處理胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞24h都能促進(jìn)Sp1與芳香化酶基因啟動(dòng)子PI.1的結(jié)合。同時(shí)，α-h-CRH(1μM)以及hCG抗體(1∶100)單獨(dú)都可以部分阻斷皮質(zhì)醇對(duì)Sp1表達(dá)的誘導(dǎo)作用以及皮質(zhì)醇對(duì)Sp1與芳香化酶基因啟動(dòng)子PI.1結(jié)合的促進(jìn)作用;且當(dāng)兩者聯(lián)合給藥時(shí)，則不僅可以降

14、低Sp1的基礎(chǔ)表達(dá)以及Sp1與芳香化酶基因啟動(dòng)子PI.1基礎(chǔ)結(jié)合，而且還可以進(jìn)一步完全阻斷皮質(zhì)醇對(duì)Sp1的誘導(dǎo)作用以及皮質(zhì)醇對(duì)Sp1與芳香化酶基因啟動(dòng)子PI.1結(jié)合的促進(jìn)作用。這些結(jié)果說(shuō)明，Sp1介導(dǎo)了皮質(zhì)醇對(duì)胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞芳香化酶表達(dá)的誘導(dǎo)作用。皮質(zhì)醇(1μM)、Forskolin(100μM)和db-cAMP(100μM)除了可以增加Sp1與胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞芳香化酶基因啟動(dòng)子PI.1的結(jié)合外，還可以增加胎盤(pán)芳香化酶基因啟動(dòng)子P

15、I.1上組蛋白3第九位賴氨酸的乙酰化(Acetyl H3K9)水平，并降低組蛋白3第九位賴氨酸的雙甲基化(Dimethyl H3K9)水平，同時(shí)還能增加RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)與芳香化酶基因啟動(dòng)子PI.1的結(jié)合，這說(shuō)明胎盤(pán)芳香化酶啟動(dòng)子PI.1上組蛋白3的乙?；碗p甲基化也參與了皮質(zhì)醇對(duì)胎盤(pán)芳香化酶基因的表達(dá)調(diào)控。
　　結(jié)論：
　　研究結(jié)果表明，人胎盤(pán)芳香化酶主要在胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)，且隨著胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞向合體滋養(yǎng)層

16、細(xì)胞的融合而逐漸增加，此外，在合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中，芳香化酶基因主要表達(dá)包含外顯子Ⅰ.1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。我們的研究結(jié)果還表明，在人類胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中，皮質(zhì)醇可以上調(diào)胎盤(pán)芳香化酶的表達(dá)，從而增加雌激素的合成。皮質(zhì)醇通過(guò)結(jié)合其自身受體GR，進(jìn)而誘導(dǎo)了胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中CRH和hCG的合成與分泌，分泌到細(xì)胞外的CRH和hCG激活胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞胞內(nèi)cAMP/PKA信號(hào)通路，該通路導(dǎo)致Sp1表達(dá)的增加以及Sp1與芳香化酶基因啟動(dòng)子PI.1的結(jié)合