殼聚糖對導(dǎo)管大腸埃希菌生物被膜形成和清除的影響.pdf

1、目的：細(xì)菌在人體內(nèi)外生存的主要形式是生物被膜，與生物被膜相關(guān)的感染在臨床上非常普遍。本研究以導(dǎo)管為載體建立大腸埃希菌生物被膜的體外模型，通過實驗組和對照組的細(xì)菌計數(shù)、生物被膜定量、銀染色和掃描電鏡的觀察，來研究殼聚糖、甲殼素是否能抑制生物被膜的形成；用細(xì)菌計數(shù)來研究殼聚糖、甲殼素是否能清除生物被膜細(xì)菌，并初步探討其作用機制。 方法： 1.將甲殼素和分子量5000、30萬、100萬殼聚糖包被在導(dǎo)管上，設(shè)空白導(dǎo)管為第1組，包

2、被分子量5000殼聚糖的導(dǎo)管為第2組，包被分子量30萬殼聚糖的導(dǎo)管為第3組，包被分子量100萬殼聚糖的導(dǎo)管為第4組，包被甲殼素的導(dǎo)管為第5組。用相同的培養(yǎng)方法分別建立大腸埃希菌生物被膜，7天后對各組進行細(xì)菌計數(shù)、測結(jié)晶紫染色的吸光度值、銀染色與掃描電子顯微鏡的觀察以及細(xì)菌的抗生素藥敏測定。 2.以空白導(dǎo)管為載體建立大腸埃希菌生物被膜模型，7天后將模型分別放入3％的醋酸溶液、1％的甲殼素酸溶液、分子量5000、30萬、100萬殼聚

3、糖酸溶液中，在36℃孵育。以3％的醋酸溶液為第1組、分子量5000的殼聚糖酸溶液為第2組、分子量30萬的殼聚糖酸溶液為第3組、分子量100萬的殼聚糖酸溶液為第4組、甲殼素酸溶液為第5組，分別在0h、48h、96h時對各組細(xì)菌計數(shù)。 3.統(tǒng)計學(xué)方法： 細(xì)菌計數(shù)、吸光度值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，抑菌環(huán)直徑以均值表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，設(shè)P＜0.05有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)果： 1對生物被膜形成的影響

4、1.1實驗1、2、3、4和5組的細(xì)菌計數(shù)值依次是2.29×107 cfu/ml、1.19×107 cfu/ml、1.45×107cfu/ml、1.99×107cfu/ml和2.15×107cfu/ml。第2、3實驗組分別與第1組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，說明分子量5000、30萬殼聚糖具有在大腸埃希菌生物被膜形成中減少細(xì)菌數(shù)量的作用；第4、5實驗組分別與第1組比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，說明分子量100萬殼聚糖和甲

5、殼素不具有在大腸埃希菌生物被膜形成中減少細(xì)菌數(shù)量的作用；第2實驗組和第3實驗組比較，第2實驗組的作用更明顯(P＜0.05)。 1.2實驗1、2、3、4和5組染色后的吸光度值依次是：0.137、0.050、0.080、0.135和0.138。第2、3實驗組分別與第1組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，說明分子量5000、30萬殼聚糖具有使大腸埃希菌生物被膜形成量減少的作用；第4、5實驗組分別與第1組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.0

6、5)，說明甲殼素和分子量100萬殼聚糖不具有使大腸埃希菌生物被膜形成量減少的作用；第2實驗組和第3實驗組比較，第2實驗組的作用更加明顯(P＜0.05)。 1.3銀染色結(jié)果：實驗1組銀染照片中絮狀的膜樣物為生物被膜。實驗2組、3組的銀染照片可見少量散落的黑點或黑斑，無黑染的絮狀膜樣物。實驗4組、5組銀染照片，可見較多散落的黑點或黑斑，有黑染的絮狀膜樣物。 1.4掃描電鏡觀察：實驗1組的細(xì)菌分布較均勻、密集，少量細(xì)菌聚集成團；進一步

7、放大可見細(xì)菌的細(xì)胞壁光滑、菌體規(guī)則、兩端鈍圓，細(xì)菌間有胞外物交聯(lián)。實驗2組、3組菌落分布較少，因為包被了殼聚糖而呈聚集狀，膜狀物為殼聚糖；進一步放大見菌體有凹陷、切痕、扭曲現(xiàn)象。實驗4組、5組細(xì)菌密集分布，大小不一。 1.5藥敏測定：包被殼聚糖的實驗2組、3組、4組和包被甲殼素的實驗5組分別與實驗1組比較，對細(xì)菌耐藥性無影響。 2.對生物被膜清除的影響Oh 時各實驗組的細(xì)菌計數(shù)值均為：22.9×106cfu/ml。第1、

8、2、3、4和5實驗組48h時細(xì)菌計數(shù)值依次是：3.95×106cfu/ml、1.52×106cfu/ml、3.33×106cfu/ml、3.70 X 106cfu/ml和3.80×106cfu/ml；96h時細(xì)菌計數(shù)值依次是：2.17×106cfu/ml、1.29×106cfu/ml、1.70×106cfu/ml、1.80×106cfu/ml和1.84×106cfu/ml。 在48h時，第2組、3組分別與第1組比較，有顯著統(tǒng)計學(xué)

9、差異(P＜0.05)，說明分子量5000、30萬殼聚糖具有清除大腸埃希菌生物被膜細(xì)菌的作用；第4、5實驗組分別與第1組比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，說明甲殼素、分子量100萬殼聚糖無清除大腸埃希菌生物被膜細(xì)菌的作用。第2和第3實驗組比較，第2組的清除作用明顯(P＜0.05)。 在96h時，只有第2組與第1組比較，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，說明分子量5000殼聚糖仍具有清除大腸埃希菌生物被膜細(xì)菌的作用；第3、4、5

10、實驗組與第1組比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，說明甲殼素、分子量30萬、100萬殼聚糖無清除大腸埃希菌生物被膜細(xì)菌的作用。結(jié)論： 1、分子量5000、30萬的殼聚糖對大腸埃希菌生物被膜的形成有抑制作用，而且分子量5000殼聚糖的抑制作用比30萬分子量殼聚糖明顯。 2、48h時，分子量5000、30萬的殼聚糖都有清除大腸埃希菌生物被膜細(xì)菌的作用；96h時，只有5000分子量殼聚糖具有清除作用。分子量5000殼聚糖的清