COX-2在兔自體移植靜脈增生模型中的表達及對其干預的實驗研究.pdf

1、目的： 冠心病是嚴重危害人類健康的疾病,隨著國人生活和飲食習慣的改變,該病的發(fā)病率和死亡率也逐年上升。冠狀動脈旁路移植術(shù)(CABG)是目前外科治療冠心病的主要方法,它可以明顯改善患者生活質(zhì)量和延長壽命。乳內(nèi)動脈和大隱靜脈是目前CABG的主要材料,其中大隱靜脈的使用最為常見,但術(shù)后大隱靜脈的遠期通暢率并不能令人滿意。研究表明應用大隱靜脈行CABG后第一年有12-27％的靜脈移植物閉塞,5年后其阻塞率為25-31％,以后阻塞率以每年

2、2-4％的速度增長,術(shù)后10年有48-66％的靜脈移植物完全阻塞,并因此有大約10％的患者需重新手術(shù)。因此,如何防治CABG術(shù)后移植靜脈再狹窄一直是學者研究的熱點。 環(huán)氧化酶(Cyclooxygenase,COX)又名前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶,是一種膜結(jié)合蛋白,具有環(huán)氧合酶和過氧化物合成酶雙重酶的功能,是體內(nèi)花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素(prostaglandin,PG)的關鍵酶。醫(yī)學上對COX的認識源于對疼痛和炎癥的研究,COX是

3、炎癥的重要介質(zhì)前列腺素生物合成的關鍵酶。人們在研究中發(fā)現(xiàn),COX有兩種異構(gòu)體,即COX-1、COX-2,前者為結(jié)構(gòu)型酶,主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),參與機體正常的生理過程與功能,而后者為誘導型酶,多分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜,在基礎水平表達極低,而在炎癥等刺激情況下表達成倍增長。自發(fā)現(xiàn)COX抑制劑阿司匹林對動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)相關疾病有防治作用后,COX與炎癥反應密切相關的同工酶COX-2成為關注的焦點。多年的研究證實,A

4、S的病理生理過程也是一種慢性炎癥反應的過程,其本質(zhì)為炎癥性疾病,系統(tǒng)監(jiān)測炎癥標志物的變化已經(jīng)成為AS相關疾病現(xiàn)代防治的一大進展。 目前,已有的研究發(fā)現(xiàn)了COX-2參與動脈粥樣硬化的證據(jù)。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應法對人類AS斑塊的分子生物學研究發(fā)現(xiàn),AS部位血管的COX-2 mRNA表達是正常血管對照的4.8倍,而COX-1 mRNA表達僅為正常對照的1.1倍。采用免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)人類AS病變的各細胞成份均有大量COX-2蛋白表

5、達,而在無AS病變的正常血管壁無表達。同時,有研究發(fā)現(xiàn)COX-2不僅參與AS的形成,而且可能在其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中均具有重要影響。而在研究兔動脈球囊擴張損傷的動物實驗時發(fā)現(xiàn),損傷動脈平滑肌細胞中的COX-2 mRNA的表達水平明顯高于正常對照組,而COX-2選擇性抑制劑可抑制它的表達；并且,使用COX-2選擇性抑制劑可以減輕實驗中血管球囊擴張損傷后的炎癥反應及內(nèi)膜增殖。冠狀動脈旁路移植術(shù)(CABG)后移植靜脈的再狹窄,表現(xiàn)為移植靜脈

6、血管內(nèi)膜及平滑肌的增殖,晚期也表現(xiàn)為粥樣硬化。據(jù)此,我們假設,COX-2在移植靜脈再狹窄模型中會明顯表達增高,并且,COX-2的表達與靜脈的再狹窄過程相關。據(jù)此假設,我們進行本課題的研究。 研究目的有：①以兔為實驗動物建立穩(wěn)定的自體移植靜脈模型,證實COX-2在移植靜脈中會有明顯的表達異常；②原代培養(yǎng)出兔靜脈血管內(nèi)皮及平滑肌細胞,并可連續(xù)傳代,滿足體外實驗需要；③建立有效的RNA干擾系統(tǒng),可在細胞實驗中高效特異的抑制兔靜脈細胞C

7、OX-2的表達；④使用RNAi技術(shù)及COX-2特異性抑制劑在細胞實驗中檢測COX-2的表達情況與兔靜脈血管內(nèi)皮及平滑肌細胞的增殖過程的相關性；⑤通過使用COX-2特異性抑制劑,在動物實驗中證實干預COX-2的表達可以影響移植靜脈增生、狹窄的進程。 方法： 1、研究COX-2在兔自體移植靜脈血管壁中的表達情況 取新西蘭大白兔(體重2.2～2.5kg)24只,雌雄不限,隨機分成3組,每組8只。耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉3

8、0mg/kg麻醉后,以"Cuff"套管法行單側(cè)頸外靜脈-頸總動脈自體移植手術(shù)。術(shù)后前三天每12小時肌注青霉素20萬U,皮下注射肝素鈉1mg/kg。三組兔分別于術(shù)后2周、8周、12周麻醉后取移植靜脈及對側(cè)頸外靜脈標本作自身對照。每個標本分成兩部分,一半行免疫組化染色；一半保存于液氮中,備實時定量PCR使用。研究觀察：①鏡下觀察靜脈切片免疫組化染色差異；②通過提取靜脈標本總RNA,反轉(zhuǎn)錄后行實時定量PCR檢測,量化的反應組織中COX-2的表

9、達情況。 2、兔靜脈內(nèi)皮、平滑肌細胞的培養(yǎng) 新西蘭大白兔麻醉后取下腔靜脈作為細胞培養(yǎng)組織。分離血管時盡量剝盡外膜,血管取下后快速使用37℃預熱的生理鹽水漂洗盡血液,暫存于37℃無血清培養(yǎng)基中,移至無菌操作臺。擬行平滑肌細胞培養(yǎng)的靜脈血管,先將其翻轉(zhuǎn)后置于0.1％I型膠原酶中,37℃孵育20分鐘后充分漂洗,去除內(nèi)皮細胞,將血管剪成長約1～2mm的小段,再沿血管縱向?qū)⑵浼舫蓛砂?將血管面展開后行貼塊法培養(yǎng),培養(yǎng)基為M199(

10、含20％胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/mI)。擬行內(nèi)皮細胞培養(yǎng)的靜脈血管,直接將其剪成長約1～2mm的小段,再沿血管縱向?qū)⑵浼舫蓛砂?將血管面展開后行貼塊法培養(yǎng),培養(yǎng)基為RPMI-1640(含20％胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml、肝素100μg/ml、胰島素100μg/ml、氫化可的松100μg/ml)。細胞傳代培養(yǎng)后根據(jù)形態(tài)學觀察確定為平滑肌細胞或內(nèi)皮細胞,同時行a平滑肌肌動蛋白(a-SMA

11、)及Ⅷ因子免疫組化方法鑒定其來源。 3、體外干預兔靜脈內(nèi)皮、平滑肌細胞COX-2的表達,觀察其對細胞增長的影響 首先,應用EGFP報告基因體外篩選干擾兔COX-2較有效的siRNA位點；然后,使用選出的siRNA片段及已知的COX-2抑制劑NS-398體外干預兔靜脈內(nèi)皮及平滑肌細胞COX-2的表達,檢測其對細胞生長的影響。檢測指標有：①免疫組化染色；②MTT法測細胞數(shù)；③流式細胞儀測細胞周期；④流式細胞儀檢測細胞凋亡率；

12、⑤實時定量PCR測COX-2 mRNA的表達情況；⑥免疫印跡法(westernblot)檢測COX-2、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達情況。 4、COX-2抑制劑對兔自體移植靜脈血管壁重構(gòu)的影響 取新西蘭大白兔(體重2.2～2.5kg)48只,雌雄不限。隨機分成3組,每組16只,每組兔子再隨機分為對照組及實驗組兩組,每組8只。均行自體頸外靜脈-頸總動脈移植手術(shù)。術(shù)后前三天每12小時肌注青霉素20萬U,皮下注射肝素

13、鈉1mg/kg,實驗組每日灌胃給予COX-2抑制劑塞來昔布(Celecoxib)-次,劑量為5mg/kg。三組兔分別于術(shù)后2周、8周、12周麻醉后取移植靜脈檢測。每個標本分成兩部分,一半行免疫組化染色；一半保存于液氮中,備實時定量PCR使用。檢測指標有：①HE、VB染色,光鏡下測量血管壁內(nèi)膜、中膜厚度；②免疫組化染色觀察不同組靜脈陽性染色程度差異；③提取標本總RNA,反轉(zhuǎn)錄后行實時定量PCR檢測,量化比較各組COX-2mRNA表達的差異

14、。 結(jié)果： 1、證實COX-2在移植靜脈中表達明顯增高鏡下觀察免疫組化切片標本發(fā)現(xiàn),正常靜脈無明顯陽性染色,而三個時間點的移植靜脈切片標本均呈強陽性染色。實時定量PCR反應顯示,移植靜脈中COX-2mRNA表達明顯增高。 2、成功培養(yǎng)出兔靜脈內(nèi)皮、平滑肌細胞,并可連續(xù)傳代先行消化去內(nèi)皮細胞的靜脈血管,通過貼塊法使用M199(含20％胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml)培養(yǎng),5天左右可見組織周圍

15、有長梭形細胞爬出,9天左右細胞成片生長,呈單層束狀,排列緊密。 3、證實在體外抑制COX-2的表達可抑制兔靜脈內(nèi)皮及平滑肌細胞的增殖本部分實驗成功篩選出有效的兔COX-2干擾位點。使用RNA干擾及COX-2抑制劑體外抑制COX-2的表達。 4、證實使用COX-2抑制劑可以影響兔自體移植靜脈血管壁增殖的進程取各時間點移植靜脈標本行HE、VB染色,光鏡下測量血管壁內(nèi)膜及中膜厚度。 結(jié)論： 1、COX-2在正常

16、靜脈中呈低表達,而在動脈化的移植靜脈中呈明顯的高表達。 2、建立簡單有效的原代培養(yǎng)兔靜脈內(nèi)皮及平滑肌細胞的方法,且所得細胞可以連續(xù)傳代,滿足實驗所需。 3、應用EGFP報告基因可在體外成功篩選干擾兔COX-2的較有效siRNA位點。 4、體外使用RNA干擾技術(shù)及COX-2特異性抑制劑NS-398均可抑制兔靜脈內(nèi)皮及平滑肌細胞COX-2 mRNA的表達,并可抑制靜脈細胞增殖。 5、使用COX-2抑制劑可誘導